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연구논문

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Public Health Weekly Report 2024; 17(20): 859-873

Published online December 29, 2023

https://doi.org/10.56786/PHWR.2024.17.20.3

© The Korea Disease Control and Prevention Agency

국내 원숭이두창 바이러스 전장유전체분석: 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱 방법 비교

최치환, 이민지, 이상은, 신화철, 최명민, 김진원, 이화중, 정윤석*

질병관리청 감염병진단분석국 고위험병원체분석과

*Corresponding author: 정윤석, Tel: +82-43-719-8270, E-mail: rollstone93@korea.kr

Received: November 28, 2023; Revised: December 26, 2023; Accepted: December 28, 2023

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

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본 연구에서는 2022년 5월부터 2023년 11월까지 국내에서 발생한 엠폭스 양성환자의 검체를 통해 원숭이두창 바이러스(monkeypox virus, MPXV)의 전장유전체 정보를 분석했다. 엠폭스는 아프리카 지역에서 발생하는 감염병으로, 2022년 5월에 영국에서 최초의 감염 사례가 확인된 이후 전 세계로 확산하였다. 국내에서는 23년 11월 24일 기준, 155건의 감염 사례가 발생하였고, 주된 감염경로는 유증상자와의 밀접한 접촉으로 확인되었다. 엠폭스의 원인 병원체인 MPXV는 약 197,000 bp 크기의 이중 가닥 DNA로 이루어져 있으며, 약 191개의 유전자와 양쪽 말단의 역위말단반복 부위, 그리고 중심보존부위를 포함하고 있다. 유전형은 클레이드 I (중앙아프리카형)과 클레이드 II (서아프리카형)으로 나뉘며, 클레이드 I는 1–10% 이하의 치명률을, 클레이드 II는 1% 미만의 치명률로 보고되었다. 연구에서는 두 가지 시퀀싱 방법, 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱을 통해 전장유전체 분석을 수행하였다. 액상 혼성화 시퀀싱은 MPXV 리드 서열을 메타지노믹 시퀀싱에 비해 효과적으로 생산하는 데 우수함을 나타냈다. 검체 종류에 따라 생산되는 바이러스 리드의 비율이 다르며, 이를 고려하여 전장유전체 분석에 활용할 검체 종류를 선택하였다. 유전체 계통분석 결과, 국내에서 발생한 엠폭스 바이러스는 해외에서 유입된 리니지 C.1에 속하는 것으로 확인되었다. 이는 국내에서의 지속적인 전파를 시사하며, 국내 및 국제적인 MPXV 변이에 대한 대응을 위한 중요한 단서를 제공한다. 또한 감염 경로를 파악하고 감염병 대응 및 예방 전략을 개선하는 데 기여할 것으로 기대된다.

Keywords 원숭이두창 바이러스, 전장유전체분석, 계통발생학적 분석

서 론

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핵심요약

① 이전에 알려진 내용은?

원숭이두창 바이러스에 의해 감염되는 엠폭스는 2022년 5월 이후 전 세계로 유행하였고, 국내 첫 번째 환자의 원숭이두창 바이러스는 클레이드 IIb, 리니지 B.1.1에 속함을 확인하였다.

② 새로이 알게 된 내용은?

2022년 국내에서 보고된 원숭이두창 바이러스는 리니지 B.1.1과 A.2.1에 속함을 확인하였으며, 이와 다르게 2023년 5월부터 11월까지 확인된 원숭이두창 바이러스는 클레이드 IIb, 리니지 C.1에 속하였다. 이는 해외에서 유입된 바이러스가 지역사회에 전파되었음을 시사한다.

③ 시사점은?

질병관리청은 엠폭스 첫 환자가 발생한 시점인 2022년부터 6월부터 2023년 11월까지 원숭이두창 바이러스 유전체 정보를 지속적으로 수집, 분석하여 바이러스의 새로운 변이와 전파 양상을 모니터링하고 있다. 이러한 접근 방법을 통해서 바이러스의 다양한 위험 변이 식별 및 전파 경로를 과학적으로 파악할 수 있다. 또한 확보된 전장유전체 정보는 감염병 진단, 백신, 치료제 개발을 위한 기초연구자료와 효과적인 예방 조치 및 치료 전략 등의 근거자료로 활용될 수 있다.

원숭이두창 바이러스(monkeypox virus, MPXV)에 의해 감염되는 엠폭스는 1958년 원숭이에서 처음 발견된 이후 1970년 인체감염이 확인되었다. 엠폭스는 중앙아프리카와 서부 아프리카 지역의 풍토병이었으나 2022년 5월 6일 영국인의 나이지리아 여행 후 감염이 확인되었고, 이후 유럽과 북미를 중심으로 비풍토병 지역에서 이례적으로 유행하는 감염병이다[1]. 이 바이러스는 2019년 Sars-Cov-2 바이러스(코로나바이러스감염증-19의 원인 바이러스) 이후 전 세계 유행을 일으킨 또 하나의 위험한 바이러스로 분류되어, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 2022년 7월부터 2023년 5월까지 약 10개월간 국제공중보건상황(Public Health Emergency of International Concern)을 이끈 원인이기도 하다[2]. 질병관리청 검사보고에 따르면 2022년 6월부터 2023년 11월까지 155건이 발생하였고[3], 사망보고는 없으며, 감염경로는 의료노출 1건을 제외하고 유증상자와의 밀접한 접촉에 의한 것으로 보고되었다[4]. MPXV는 약 197,000 bp의 이중 가닥 DNA로 191개의 유전자로 이루어지며 유전체 서열 양쪽 말단에 역위말단반복(inverted terminal repeat) 부위가 존재한다[5]. 유전형은 중앙아프리카형과 서아프리카형으로 나뉜다. 2022년 8월 WHO에 의해 전자는 클레이드 I, 후자는 클레이드 II (서브클레이드 a, b)로 재명명되었고[6], 유전형에 따른 치명률은 클레이드 I의 경우 1-10% 이하, 클레이드 II의 경우 1% 미만으로 보고된다[7]. 같은 종의 바이러스라도 클레이드에 따라 인체에 더욱 치명적이므로 엠폭스 진단 이후 유전체분석을 통해 국내에서 유행하는 바이러스의 클레이드를 확인하는 과정을 간과할 수 없다. 2023년 11월 공공 유전체 데이터베이스(Genbank)에 등재된 바이러스 유전체는 약 6,900건이며, 이 중 2022년 5월 이후 등록된 유전체가 6,354건을 차지한다[8]. 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)의 기술 발전과 보급으로 전 세계 국가가 엠폭스 양성환자의 검체에서 빠르게 바이러스 유전체를 분석하여 바이러스 특성과 유행양상을 확인 및 공유하면서 지속적으로 유전체 감시(genomic surveillance)에 힘쓰고 있다. 본 원고에서는 국내에서 발생한 엠폭스 양성 환자의 검체로부터 얻어진 바이러스를 NGS 기술을 이용하여 전장유전체 분석을 수행하는 방법과 결과를 기술하고, 국내에서 유행하는 바이러스 분류와 변이 등을 지속적으로 모니터링하기 위한 유전체 감시 방법을 소개한다.

방 법

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국내 바이러스 전장 유전체 분석은 ‘메타지노믹 시퀀싱(metagenomic sequencing)’과 ‘액상 혼성화(hybridization capture)를 이용한 시퀀싱’ 두 가지 방법으로 수행되었다. 일반적으로는 NGS 수행을 위해 다음과 같은 단계를 거친다. 검체에서 DNA를 추출한 후 시퀀싱을 위해 DNA나 RNA 모음 형태인 라이브러리로 제작하고, 이를 이용하여 NGS 기기에서 유전체 리드를 생산하게 된다. 단, 라이브러리 제작은 환자의 검체 내에 있는 모든 DNA를 생산하는 메타지노믹 시퀀싱과 특정 바이러스 유전체만을 목표로 시퀀싱하는 액상 혼성화를 이용한 시퀀싱 방법에 따라 준비하였으며, MiSeq NGS 기기(Illumina, Inc.)에서 생산하였다. 2022년에 생산된 유전체의 경우는 환자의 검체에서 바이러스를 분리·배양 후 메타지노믹 시퀀싱을 적용하여 생산하였으며, 2023년도부터는 환자가 급증함에 따라 그에 대응하기 위해 참조유전체로부터 고안된 프로브를 활용한 액상 혼성화 방식을 이용하여 MPXV만을 증폭하는 두 번째 시퀀싱 방법으로 생산하였다. 여기에서 프로브는 DNA나 RNA와 상호작용하여 특정 유전자나 염기 서열을 찾아내는 작은 조각이다.

1. 메타지노믹 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 방법

환자의 검체 또는 세포 배양을 통해 분리·배양한 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위하여 컬럼 방식의 QIAamp DNA blood minikit (Qiagen)를 사용하였으며, 추출한 핵산은 Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)를 이용하여 정량 및 표준화하였다. 메타지노믹 시퀀싱을 위해서 Illumina Inc.의 Miseq NGS 기기을 이용하였다. 약 100-500 ng의 추출 DNA를 이용하여 Miseq NGS 기기에 적합한 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 제작을 위해 먼저 bead-linked transposomes를 이용하여 DNA를 조각냄과 동시에 시퀀싱 기기에서 읽을 수 있는 어댑터 시퀀스를 도입하는 태그멘테이션(tagmentation) 단계를 거치고, 이어서 태그된 DNA만을 획득하는 정제 단계를 거쳤다. 이렇게 태그된 DNA를 활용하여 인덱스 어댑터(Illumina, 20091654)와 함께 중합효소연쇄반응을 활용한 증폭 단계를 거쳐 시퀀싱 기기를 위한 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 비드(bead)를 이용한 정제 단계를 거치고, Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)와 전자포토메트릭 감지 기술을 활용한 TapeStation (Agilent Technologies) 장비를 통하여 형성된 라이브러리의 농도와 크기를 정확하게 측정하고 제작된 라이브러리의 품질을 평가하였다. 최종 약 10 pM의 라이브러리를 이용하여 시퀀싱하였다. 라이브러리 제작을 위한 모든 과정은 Illumina DNA prep (M) Tagmentation (20060060) 시약을 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 정밀하게 수행하였다.

2. 액상 혼성화 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 방법

검체의 모든 DNA를 생산하는 메타지노믹 시퀀싱은 편향되지 않은 결과를 생산할 수 있다는 장점이 있으나 우리가 얻고자 하는 MPXV 리드 서열의 비율이 높지 않아 시퀀싱 효율이 떨어지므로 이를 보완하기 위해 액상 혼성화 시퀀싱 분석 방법을 도입하였다. 액상 혼성화 시퀀싱 방법을 위한 라이브러리 제작은 농축(enrichment) 단계를 추가적으로 거친다. 라이브러리 제작을 위해 필요한 핵산은 동일하게 QIAamp DNA blood minikit (Qiagen)를 사용하여 추출하였으며, Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)를 이용하여 정량 및 표준화하였다. 메타지노믹 시퀀싱 분석 방법에서 사용한 것보다 적은 양인 약 10-100 ng의 추출된 DNA를 이용하여 라이브러리를 제작하였으며 초기 단계는 위와 동일하다. Bead-linked transposomes를 이용하여 조각낸 DNA를 어댑터 시퀀스 도입을 위한 태그 단계를 거치고, 정제하여 태그된 DNA만을 인덱스 어댑터(Illumina, 20091654)와 함께 증폭하였다. 증폭된 라이브러리를 정제하고 정량 및 표준화한 후 액상 혼성화 시퀀싱을 위한 농축 단계를 거쳤다. 이때 Illumina Inc.의 Viral Surveillance Panel (VSP)을 활용하였는데, 이는 우리가 얻고자 하는 MPXV를 포함한 60여 개의 바이러스를 타깃으로 하는 프로브 조합으로 고안된 패널이다. VSP 패널을 활용하여 MPXV를 포획하기 위하여 증폭된 라이브러리를 VSP 패널을 포함한 반응 시약과 함께 Thermo Cycler (Applied Biosystems)에 두고 정확한 온도 제어를 통하여 액상 혼성화하였다. 이 과정은 58℃에서 최소 16시간 정치하여야 하므로 메타지노믹 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 과정보다 하루 정도의 시간이 더 소모되었다. 이렇게 포획된 라이브러리는 마그네틱 비드를 활용하여 정제한 후 액상 혼성화된 라이브러리만을 추출하였다. 이렇게 액상 혼성화를 통하여 MPXV를 포획한 라이브러리는 증폭 단계와 정제 단계를 거치고 Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)와 전자포토메트릭 감지 기술을 활용한 TapeStation (Agilent Technologies) 장비를 이용하여 품질을 평가하였다. 최종 약 9 pM의 제작된 라이브러리를 이용하여 시퀀싱하였다. 라이브러리 제작을 위한 모든 과정은 Illumina RNA Prep with Enrichment Tagmentation (20040536) 시약을 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 정밀하게 수행하였다.

3. 전장유전체 분석 및 평가

MiSeq NGS 기기에서 생산된 paired-end 형식의 리드서열은 Kraken2 [9]를 이용하여 호스트 게놈(hg19)을 제거한다. CLC Genomics Workbench 20 (CGW) 도구를 사용하여 유전체 분석을 진행하며, 입력 파라미터를 명시하지 않는 경우는 기본값으로 수행한다. 제거된 리드서열은 trimming threshold 0.001 파라미터를 사용하여 어댑터 서열과 Q30 이하의 낮은 품질의 리드를 필터링한다. CGW의 resequencing 기능을 통해 참조유전체(NC_063383.1)를 이용하여 리드를 매핑하고, de novo assembly 기능을 이용하여 컨티그로 조립 후 리드매핑된 서열과 컨티그를 비교 분석하여 최종적으로 유전체의 구조 변형의 유무를 분석하고 최종서열을 완성한다. 완성된 서열은 QUAST [10]를 통해 전장유전체의 완성도를 평가하며, NextClade [11]를 사용하여 최종 클레이드와 변이를 확인한다.

이렇게 완성된 유전체는 Nextstrain 분석 파이프라인[12]을 통해 전 세계 공공 유전체 데이터베이스에 등록된 유전체를 대상으로 유연관계를 확인하였다. Nextstrain의 분석 파이프라인은 워크플로 프로그램인 Snakemake [13]를 사용하여 Augur [14] 등의 분석도구와 방법을 정의한 규칙에 따라 분석을 수행하며, 최종 결과를 auspice를 통해 시각화한다. 추가적으로 Apobec3에 의한 변이(TC→TT, GA→AA)를 분석하기 위해 mutation profile [15]을 사용하여 확인하였다.

결 과

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메타지노믹 시퀀싱 방법, 액상 혼성화 시퀀싱 방법으로 생산된 NGS 리드의 서열은 표 1과 같이 도출되었다. 메타지노믹 시퀀싱 방법을 이용한 경우, MPXV 리드서열은 10% 미만으로 생산되는 반면 액상 혼성화 시퀀싱 방법의 경우, MPXV 리드 서열이 90% 이상 생산됨을 확인하였다. 액상 혼성화 시퀀싱은 시퀀싱 효율을 높인다는 장점이 있으나 메타지노믹 시퀀싱 방법과 비교했을 때 라이브러리 제작을 위한 농축 단계를 거쳐야 하므로 시간과 비용이 추가적으로 소요되었다. 검체의 종류에 따라 생산되는 바이러스 NGS 리드는 투입되는 검체 수에 따라 감소하므로, 전체 생산량 대비 바이러스 리드 비율로 환산할 경우 가피, 피부병변, 구인두도말, 혈액 순으로 생산비율의 차이를 보였다. 생산되는 바이러스 NGS 리드는 검체의 바이러스 양에 따라 달라질 수 있다. 이전 결과에 따르면 같은 환자의 여러 부위에서 채취된 검체의 바이러스 양은 다양하며, 이러한 점을 고려하였을 때 정확한 진단과 분석을 위하여 다양한 부위에서 여러 종류의 검체를 채취하는 것이 필요하다[16].

검체별 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱 분석 방법에 따른 바이러스 리드 비교
ID검체(CT값a))메타지노믹 시퀀싱액상 혼성화 시퀀싱
바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)
MPXV-ROK-P002-2022구인두도말(34.81)0.5% (123,258/21,578,224)65%/12X83% (248,504/297,732)100%/166X
MPXV-ROK-P003-2022피부병변(23.11)5% (241,032/4,282,341)100%/225X98% (13,562,486/13,826,110)100%/8,860X
MPXV-ROK-P003-2022가피(26.35)11% (602,146/5,616,046)100%/600XN/AN/A
MPXV-ROK-P003-2022구인두도말(27.53)0.7% (34,894/4,919,884)99%/10XN/AN/A

a)CT값=threshold of cycle, CT값은 주로 어떤 유전자에 대한 DNA 또는 RNA의 양을 나타내는 지표로 CT값이 낮을수록 유전자나 시험 대상의 양이 많이 포함되어 있음. b)바이러스 리드 비율=바이러스 유전체에 해당하는 염기서열 조각 개수(바이러스 리드)÷총 생산된 염기서열 조각 개수(저체 리드)×100. c)유전체 커버리지=리드서열이 커버하는 전체 바이러스 유전체에 대한 비율. d)커버리지 정도=유전체의 특정 위치에서 평균적으로 얼마나 많은 염기서열 조각이 중첩되었는지 나타내는 지표.

위와 같은 결과를 바탕으로 전장유전체 분석에 활용되는 검체는 바이러스 양이 확인된 가피, 피부병변을 우선하고, 액상 혼성화 시퀀싱 방법을 우선하였다. 이 결과, 전장유전체 분석은 2022년 6월부터 11월까지 국내에서 발생한 양성 환자의 검체 중 105개를 진행하였고, 완성된 일부 30개 전장유전체를 공공 유전체 데이터베이스에 공개하고 있다(표 2). NextClade를 이용한 유전체 계통을 분석한 결과, 국내에서 보고된 전장유전체의 계통이 전 세계에서 유행 중인 클레이드 IIb 중 리니지 B.1.1, A.2.1, C.1 등으로 분류되며, 이 중 2023년에 발생한 바이러스는 모두 리니지 C.1인 것으로 확인되었다. Nextstrain 사용한 유전체 계통학적 분석 결과에서도 위와 같은 결과를 확인하였다. 또한 변이분석을 위하여 CGW를 사용하여 참조유전체 서열(NC_063383.1)을 기준으로 전장유전체를 비교한 결과, 뉴클레오티드 변이가 74–86개, 아미노산 변이는 28–41개로 확인되었으며, APOBEC3 효소에 의한 변이가 80%로 확인되었다. 질병관리청에서 엠폭스 진단분석에 사용되는 A38R, F3L 유전자 부위에서의 변이는 현재까지 발견되지 않아 진단에 영향을 주지는 않는 것으로 확인되었다.

국내 발생 MPXV 전장유전체 등재현황(GenBank)
ID수집일클레이드리니지GenBank 등록번호
MPXV-ROK-P1-20222022-06-22IIbB.1.1OP204857
MPXV-ROK-P002-20222022-09-02IIbB.1.1OR459775
MPXV-ROK-P003-20222022-11-15IIbA.2.1OR459776
MPXV-ROK-P004-20222022-11-22IIbA.2.1OR459777
MPXV-ROK-P005-20232023-03-13IIbC.1OR459778
MPXV-ROK-P006-20232023-04-06IIbC.1OR459779
MPXV-ROK-P007-20232023-04-10IIbC.1OR459780
MPXV-ROK-P008-20232023-04-11IIbC.1OR459781
MPXV-ROK-P009-20232023-04-12IIbC.1OR459782
MPXV-ROK-P010-20232023-04-13IIbC.1OR459783
MPXV-ROK-P011-20232023-04-14IIbC.1OR459784
MPXV-ROK-P012-20232023-04-15IIbC.1OR459785
MPXV-ROK-P013-20232023-04-15IIbC.1OR459786
MPXV-ROK-P014-20232023-04-17IIbC.1OR459787
MPXV-ROK-P015-20232023-04-18IIbC.1OR459788
MPXV-ROK-P016-20232023-04-18IIbC.1OR459789
MPXV-ROK-P017-20232023-04-18IIbC.1OR459790
MPXV-ROK-P018-20232023-04-18IIbC.1OR459791
MPXV-ROK-P019-20232023-04-19IIbC.1OR459792
MPXV-ROK-P020-20232023-04-19IIbC.1OR459793
MPXV-ROK-P021-20232023-04-21IIbC.1OR459794
MPXV-ROK-P022-20232023-04-21IIbC.1OR459795
MPXV-ROK-P024-20232023-04-21IIbC.1OR459796
MPXV-ROK-P026-20232023-04-22IIbC.1OR459797
MPXV-ROK-P027-20232023-04-22IIbC.1OR459798
MPXV-ROK-P028-20232023-04-22IIbC.1OR459799
MPXV-ROK-P029-20232023-04-23IIbC.1OR459800
MPXV-ROK-P030-20232023-04-23IIbC.1OR459801
MPXV-ROK-P032-20232023-04-25IIbC.1OR459802
MPXV-ROK-P033-20232023-04-25IIbC.1OR459803
MPXV-ROK-P034-20232023-04-25IIbC.1OR459804

클레이드=공통의 조상에서 진화한 생물의 그룹. MPXV의 경우, 기존의 중앙아프리카 지역의 콩고-바신 바이러스를 클레이드 I으로, 서아프리카 지역의 바이러스는 클레이드 II로 나뉨; 리니지(Lineage)=공통의 조상에서 파생된 유전적으로 밀접한 관련성을 가지는 바이러스 그룹. 클레이드, 서브클레이드, 리니지 순으로 세분화됨. MPXV의 경우, A.1, B.1, C.1 등으로 세부적으로 리니지가 나뉨; Genbank 등록번호=공공 유전체 데이터베이스(GenBank)에서 부여한 등록번호; MPXV=원숭이두창 바이러스(monkeypox virus).

논 의

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본 연구에서는 NGS 기술과 생물정보분석 기술을 활용하여 2022년 5월부터 2023년 11월까지 국내에서 발생한 엠폭스 양성환자의 검체에서 MPXV의 전장유전체 정보를 성공적으로 분석하였다. 또한 액상 혼성화 시퀀싱 도입을 통해 MPXV의 유전체 리드 생산을 효과적으로 개선하였다. 전장유전체 분석 결과에 따르면 2022년 해외유입 MPXV는 리니지 B.1.1, A.2.1에 속하고, 2023년 5월부터 11월까지 국내 발생 MPXV는 리니지 C.1에 속하였다. 이는 해외에서 유입한 리니지 C.1의 MPXV가 국내 지역사회로 전파되고 있다는 가능성을 시사한다. 국내뿐 아니라 인접 국가인 일본, 중국, 대만에서 MPXV 리니지 C.1이 유행하고 있으므로 향후 국내에서 발생하는 MPXV도 같은 리니지일 가능성이 높다.

이러한 결과는 국내 MPXV의 유전체 감시의 일부분이며 향후 감염병 대응 및 예방을 위한 유전정보의 기초자료로 활용될 것으로 기대된다. 특히, 액상 혼성화 시퀀싱의 도입은 MPXV의 효율적인 분석을 가능하게 하였으며 이는 미래에 발생할 수 있는 다양한 감염병에 대한 대응 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이다.

또한 전장유전체 분석은 역학적으로 누락된 정보를 보완하고 이러한 미싱링크를 유전체적 유사성과 변이 패턴을 통해 간접적으로 파악이 가능하다. 특정 지역에서 발생한 감염 사례에서 비교유전체 분석을 실시함으로써 해외 유입된 병원체의 기원을 추정할 수 있으며, 또한 지역 사회 전파의 경우에는 지역 내 다른 환자들로부터 분리된 병원체의 유전적 유사성을 분석하여 공통된 감염 경로를 찾아낼 수 있다.

그러나 이 연구는 제한된 환자 수와 시간 범위 내에서 수행되었으며, 국내 및 국제적으로 발생 가능한 백신과 치료제에 대한 내성변이, 재조합이나 변이로 인한 병원성이나 감염성의 증가와 관련된 변이 등을 포함하여 MPXV의 다양한 변이를 다루지 못했다는 점에서 한계가 있다. 따라서 보다 많은 국내 MPXV에 대한 지역전파 클러스터 분석과 더불어 치료제에 대한 내성변이 추적, 유전자 재조합 및 변이에 따른 병원성과 감염성 분석 등의 추가적인 연구가 필요하며, 국제적인 협력을 통해 MPXV의 다양한 유전체와 변이에 대한 더 광범위한 이해를 도모할 필요가 있다. 이러한 연구는 전 세계적으로 언제든 다시 발생할 수 있는 엠폭스 감염병의 대응 및 예방을 위해 신속한 병원체 진단, 백신 및 치료제 연구와 개발, 새로운 변이에 대한 긴급 대응 및 예방 전략 수립, 더 나은 전략을 제안하는 데 기여할 것으로 기대한다.

Declarations

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Funding Source: None.

Acknowledgments: None.

Ethics Statement: None.

Conflict of Interest: The authors have no conflicts of interest to declare.

Author Contributions: Conceptualization: YSC, CHC, MJL. Resources: MJL, JWK, CHC, HCS, MMC. Supervision: YSC. Writing – original draft: CHC, MJL. Writing – review & editing: all authors.

References

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Article

연구논문

Public Health Weekly Report 2024; 17(20): 859-873

Published online May 23, 2024 https://doi.org/10.56786/PHWR.2024.17.20.3

Copyright © The Korea Disease Control and Prevention Agency.

국내 원숭이두창 바이러스 전장유전체분석: 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱 방법 비교

최치환, 이민지, 이상은, 신화철, 최명민, 김진원, 이화중, 정윤석*

질병관리청 감염병진단분석국 고위험병원체분석과

Received: November 28, 2023; Revised: December 26, 2023; Accepted: December 28, 2023

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

본 연구에서는 2022년 5월부터 2023년 11월까지 국내에서 발생한 엠폭스 양성환자의 검체를 통해 원숭이두창 바이러스(monkeypox virus, MPXV)의 전장유전체 정보를 분석했다. 엠폭스는 아프리카 지역에서 발생하는 감염병으로, 2022년 5월에 영국에서 최초의 감염 사례가 확인된 이후 전 세계로 확산하였다. 국내에서는 23년 11월 24일 기준, 155건의 감염 사례가 발생하였고, 주된 감염경로는 유증상자와의 밀접한 접촉으로 확인되었다. 엠폭스의 원인 병원체인 MPXV는 약 197,000 bp 크기의 이중 가닥 DNA로 이루어져 있으며, 약 191개의 유전자와 양쪽 말단의 역위말단반복 부위, 그리고 중심보존부위를 포함하고 있다. 유전형은 클레이드 I (중앙아프리카형)과 클레이드 II (서아프리카형)으로 나뉘며, 클레이드 I는 1–10% 이하의 치명률을, 클레이드 II는 1% 미만의 치명률로 보고되었다. 연구에서는 두 가지 시퀀싱 방법, 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱을 통해 전장유전체 분석을 수행하였다. 액상 혼성화 시퀀싱은 MPXV 리드 서열을 메타지노믹 시퀀싱에 비해 효과적으로 생산하는 데 우수함을 나타냈다. 검체 종류에 따라 생산되는 바이러스 리드의 비율이 다르며, 이를 고려하여 전장유전체 분석에 활용할 검체 종류를 선택하였다. 유전체 계통분석 결과, 국내에서 발생한 엠폭스 바이러스는 해외에서 유입된 리니지 C.1에 속하는 것으로 확인되었다. 이는 국내에서의 지속적인 전파를 시사하며, 국내 및 국제적인 MPXV 변이에 대한 대응을 위한 중요한 단서를 제공한다. 또한 감염 경로를 파악하고 감염병 대응 및 예방 전략을 개선하는 데 기여할 것으로 기대된다.

Keywords: 원숭이두창 바이러스, 전장유전체분석, 계통발생학적 분석

서 론

핵심요약

① 이전에 알려진 내용은?

원숭이두창 바이러스에 의해 감염되는 엠폭스는 2022년 5월 이후 전 세계로 유행하였고, 국내 첫 번째 환자의 원숭이두창 바이러스는 클레이드 IIb, 리니지 B.1.1에 속함을 확인하였다.

② 새로이 알게 된 내용은?

2022년 국내에서 보고된 원숭이두창 바이러스는 리니지 B.1.1과 A.2.1에 속함을 확인하였으며, 이와 다르게 2023년 5월부터 11월까지 확인된 원숭이두창 바이러스는 클레이드 IIb, 리니지 C.1에 속하였다. 이는 해외에서 유입된 바이러스가 지역사회에 전파되었음을 시사한다.

③ 시사점은?

질병관리청은 엠폭스 첫 환자가 발생한 시점인 2022년부터 6월부터 2023년 11월까지 원숭이두창 바이러스 유전체 정보를 지속적으로 수집, 분석하여 바이러스의 새로운 변이와 전파 양상을 모니터링하고 있다. 이러한 접근 방법을 통해서 바이러스의 다양한 위험 변이 식별 및 전파 경로를 과학적으로 파악할 수 있다. 또한 확보된 전장유전체 정보는 감염병 진단, 백신, 치료제 개발을 위한 기초연구자료와 효과적인 예방 조치 및 치료 전략 등의 근거자료로 활용될 수 있다.

원숭이두창 바이러스(monkeypox virus, MPXV)에 의해 감염되는 엠폭스는 1958년 원숭이에서 처음 발견된 이후 1970년 인체감염이 확인되었다. 엠폭스는 중앙아프리카와 서부 아프리카 지역의 풍토병이었으나 2022년 5월 6일 영국인의 나이지리아 여행 후 감염이 확인되었고, 이후 유럽과 북미를 중심으로 비풍토병 지역에서 이례적으로 유행하는 감염병이다[1]. 이 바이러스는 2019년 Sars-Cov-2 바이러스(코로나바이러스감염증-19의 원인 바이러스) 이후 전 세계 유행을 일으킨 또 하나의 위험한 바이러스로 분류되어, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 2022년 7월부터 2023년 5월까지 약 10개월간 국제공중보건상황(Public Health Emergency of International Concern)을 이끈 원인이기도 하다[2]. 질병관리청 검사보고에 따르면 2022년 6월부터 2023년 11월까지 155건이 발생하였고[3], 사망보고는 없으며, 감염경로는 의료노출 1건을 제외하고 유증상자와의 밀접한 접촉에 의한 것으로 보고되었다[4]. MPXV는 약 197,000 bp의 이중 가닥 DNA로 191개의 유전자로 이루어지며 유전체 서열 양쪽 말단에 역위말단반복(inverted terminal repeat) 부위가 존재한다[5]. 유전형은 중앙아프리카형과 서아프리카형으로 나뉜다. 2022년 8월 WHO에 의해 전자는 클레이드 I, 후자는 클레이드 II (서브클레이드 a, b)로 재명명되었고[6], 유전형에 따른 치명률은 클레이드 I의 경우 1-10% 이하, 클레이드 II의 경우 1% 미만으로 보고된다[7]. 같은 종의 바이러스라도 클레이드에 따라 인체에 더욱 치명적이므로 엠폭스 진단 이후 유전체분석을 통해 국내에서 유행하는 바이러스의 클레이드를 확인하는 과정을 간과할 수 없다. 2023년 11월 공공 유전체 데이터베이스(Genbank)에 등재된 바이러스 유전체는 약 6,900건이며, 이 중 2022년 5월 이후 등록된 유전체가 6,354건을 차지한다[8]. 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)의 기술 발전과 보급으로 전 세계 국가가 엠폭스 양성환자의 검체에서 빠르게 바이러스 유전체를 분석하여 바이러스 특성과 유행양상을 확인 및 공유하면서 지속적으로 유전체 감시(genomic surveillance)에 힘쓰고 있다. 본 원고에서는 국내에서 발생한 엠폭스 양성 환자의 검체로부터 얻어진 바이러스를 NGS 기술을 이용하여 전장유전체 분석을 수행하는 방법과 결과를 기술하고, 국내에서 유행하는 바이러스 분류와 변이 등을 지속적으로 모니터링하기 위한 유전체 감시 방법을 소개한다.

방 법

국내 바이러스 전장 유전체 분석은 ‘메타지노믹 시퀀싱(metagenomic sequencing)’과 ‘액상 혼성화(hybridization capture)를 이용한 시퀀싱’ 두 가지 방법으로 수행되었다. 일반적으로는 NGS 수행을 위해 다음과 같은 단계를 거친다. 검체에서 DNA를 추출한 후 시퀀싱을 위해 DNA나 RNA 모음 형태인 라이브러리로 제작하고, 이를 이용하여 NGS 기기에서 유전체 리드를 생산하게 된다. 단, 라이브러리 제작은 환자의 검체 내에 있는 모든 DNA를 생산하는 메타지노믹 시퀀싱과 특정 바이러스 유전체만을 목표로 시퀀싱하는 액상 혼성화를 이용한 시퀀싱 방법에 따라 준비하였으며, MiSeq NGS 기기(Illumina, Inc.)에서 생산하였다. 2022년에 생산된 유전체의 경우는 환자의 검체에서 바이러스를 분리·배양 후 메타지노믹 시퀀싱을 적용하여 생산하였으며, 2023년도부터는 환자가 급증함에 따라 그에 대응하기 위해 참조유전체로부터 고안된 프로브를 활용한 액상 혼성화 방식을 이용하여 MPXV만을 증폭하는 두 번째 시퀀싱 방법으로 생산하였다. 여기에서 프로브는 DNA나 RNA와 상호작용하여 특정 유전자나 염기 서열을 찾아내는 작은 조각이다.

1. 메타지노믹 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 방법

환자의 검체 또는 세포 배양을 통해 분리·배양한 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위하여 컬럼 방식의 QIAamp DNA blood minikit (Qiagen)를 사용하였으며, 추출한 핵산은 Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)를 이용하여 정량 및 표준화하였다. 메타지노믹 시퀀싱을 위해서 Illumina Inc.의 Miseq NGS 기기을 이용하였다. 약 100-500 ng의 추출 DNA를 이용하여 Miseq NGS 기기에 적합한 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 제작을 위해 먼저 bead-linked transposomes를 이용하여 DNA를 조각냄과 동시에 시퀀싱 기기에서 읽을 수 있는 어댑터 시퀀스를 도입하는 태그멘테이션(tagmentation) 단계를 거치고, 이어서 태그된 DNA만을 획득하는 정제 단계를 거쳤다. 이렇게 태그된 DNA를 활용하여 인덱스 어댑터(Illumina, 20091654)와 함께 중합효소연쇄반응을 활용한 증폭 단계를 거쳐 시퀀싱 기기를 위한 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 비드(bead)를 이용한 정제 단계를 거치고, Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)와 전자포토메트릭 감지 기술을 활용한 TapeStation (Agilent Technologies) 장비를 통하여 형성된 라이브러리의 농도와 크기를 정확하게 측정하고 제작된 라이브러리의 품질을 평가하였다. 최종 약 10 pM의 라이브러리를 이용하여 시퀀싱하였다. 라이브러리 제작을 위한 모든 과정은 Illumina DNA prep (M) Tagmentation (20060060) 시약을 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 정밀하게 수행하였다.

2. 액상 혼성화 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 방법

검체의 모든 DNA를 생산하는 메타지노믹 시퀀싱은 편향되지 않은 결과를 생산할 수 있다는 장점이 있으나 우리가 얻고자 하는 MPXV 리드 서열의 비율이 높지 않아 시퀀싱 효율이 떨어지므로 이를 보완하기 위해 액상 혼성화 시퀀싱 분석 방법을 도입하였다. 액상 혼성화 시퀀싱 방법을 위한 라이브러리 제작은 농축(enrichment) 단계를 추가적으로 거친다. 라이브러리 제작을 위해 필요한 핵산은 동일하게 QIAamp DNA blood minikit (Qiagen)를 사용하여 추출하였으며, Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)를 이용하여 정량 및 표준화하였다. 메타지노믹 시퀀싱 분석 방법에서 사용한 것보다 적은 양인 약 10-100 ng의 추출된 DNA를 이용하여 라이브러리를 제작하였으며 초기 단계는 위와 동일하다. Bead-linked transposomes를 이용하여 조각낸 DNA를 어댑터 시퀀스 도입을 위한 태그 단계를 거치고, 정제하여 태그된 DNA만을 인덱스 어댑터(Illumina, 20091654)와 함께 증폭하였다. 증폭된 라이브러리를 정제하고 정량 및 표준화한 후 액상 혼성화 시퀀싱을 위한 농축 단계를 거쳤다. 이때 Illumina Inc.의 Viral Surveillance Panel (VSP)을 활용하였는데, 이는 우리가 얻고자 하는 MPXV를 포함한 60여 개의 바이러스를 타깃으로 하는 프로브 조합으로 고안된 패널이다. VSP 패널을 활용하여 MPXV를 포획하기 위하여 증폭된 라이브러리를 VSP 패널을 포함한 반응 시약과 함께 Thermo Cycler (Applied Biosystems)에 두고 정확한 온도 제어를 통하여 액상 혼성화하였다. 이 과정은 58℃에서 최소 16시간 정치하여야 하므로 메타지노믹 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 과정보다 하루 정도의 시간이 더 소모되었다. 이렇게 포획된 라이브러리는 마그네틱 비드를 활용하여 정제한 후 액상 혼성화된 라이브러리만을 추출하였다. 이렇게 액상 혼성화를 통하여 MPXV를 포획한 라이브러리는 증폭 단계와 정제 단계를 거치고 Qubit 4 형광측정기(Invitrogen)와 전자포토메트릭 감지 기술을 활용한 TapeStation (Agilent Technologies) 장비를 이용하여 품질을 평가하였다. 최종 약 9 pM의 제작된 라이브러리를 이용하여 시퀀싱하였다. 라이브러리 제작을 위한 모든 과정은 Illumina RNA Prep with Enrichment Tagmentation (20040536) 시약을 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 정밀하게 수행하였다.

3. 전장유전체 분석 및 평가

MiSeq NGS 기기에서 생산된 paired-end 형식의 리드서열은 Kraken2 [9]를 이용하여 호스트 게놈(hg19)을 제거한다. CLC Genomics Workbench 20 (CGW) 도구를 사용하여 유전체 분석을 진행하며, 입력 파라미터를 명시하지 않는 경우는 기본값으로 수행한다. 제거된 리드서열은 trimming threshold 0.001 파라미터를 사용하여 어댑터 서열과 Q30 이하의 낮은 품질의 리드를 필터링한다. CGW의 resequencing 기능을 통해 참조유전체(NC_063383.1)를 이용하여 리드를 매핑하고, de novo assembly 기능을 이용하여 컨티그로 조립 후 리드매핑된 서열과 컨티그를 비교 분석하여 최종적으로 유전체의 구조 변형의 유무를 분석하고 최종서열을 완성한다. 완성된 서열은 QUAST [10]를 통해 전장유전체의 완성도를 평가하며, NextClade [11]를 사용하여 최종 클레이드와 변이를 확인한다.

이렇게 완성된 유전체는 Nextstrain 분석 파이프라인[12]을 통해 전 세계 공공 유전체 데이터베이스에 등록된 유전체를 대상으로 유연관계를 확인하였다. Nextstrain의 분석 파이프라인은 워크플로 프로그램인 Snakemake [13]를 사용하여 Augur [14] 등의 분석도구와 방법을 정의한 규칙에 따라 분석을 수행하며, 최종 결과를 auspice를 통해 시각화한다. 추가적으로 Apobec3에 의한 변이(TC→TT, GA→AA)를 분석하기 위해 mutation profile [15]을 사용하여 확인하였다.

결 과

메타지노믹 시퀀싱 방법, 액상 혼성화 시퀀싱 방법으로 생산된 NGS 리드의 서열은 표 1과 같이 도출되었다. 메타지노믹 시퀀싱 방법을 이용한 경우, MPXV 리드서열은 10% 미만으로 생산되는 반면 액상 혼성화 시퀀싱 방법의 경우, MPXV 리드 서열이 90% 이상 생산됨을 확인하였다. 액상 혼성화 시퀀싱은 시퀀싱 효율을 높인다는 장점이 있으나 메타지노믹 시퀀싱 방법과 비교했을 때 라이브러리 제작을 위한 농축 단계를 거쳐야 하므로 시간과 비용이 추가적으로 소요되었다. 검체의 종류에 따라 생산되는 바이러스 NGS 리드는 투입되는 검체 수에 따라 감소하므로, 전체 생산량 대비 바이러스 리드 비율로 환산할 경우 가피, 피부병변, 구인두도말, 혈액 순으로 생산비율의 차이를 보였다. 생산되는 바이러스 NGS 리드는 검체의 바이러스 양에 따라 달라질 수 있다. 이전 결과에 따르면 같은 환자의 여러 부위에서 채취된 검체의 바이러스 양은 다양하며, 이러한 점을 고려하였을 때 정확한 진단과 분석을 위하여 다양한 부위에서 여러 종류의 검체를 채취하는 것이 필요하다[16].

검체별 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱 분석 방법에 따른 바이러스 리드 비교
ID검체(CT값a))메타지노믹 시퀀싱액상 혼성화 시퀀싱
바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)
MPXV-ROK-P002-2022구인두도말(34.81)0.5% (123,258/21,578,224)65%/12X83% (248,504/297,732)100%/166X
MPXV-ROK-P003-2022피부병변(23.11)5% (241,032/4,282,341)100%/225X98% (13,562,486/13,826,110)100%/8,860X
MPXV-ROK-P003-2022가피(26.35)11% (602,146/5,616,046)100%/600XN/AN/A
MPXV-ROK-P003-2022구인두도말(27.53)0.7% (34,894/4,919,884)99%/10XN/AN/A

a)CT값=threshold of cycle, CT값은 주로 어떤 유전자에 대한 DNA 또는 RNA의 양을 나타내는 지표로 CT값이 낮을수록 유전자나 시험 대상의 양이 많이 포함되어 있음. b)바이러스 리드 비율=바이러스 유전체에 해당하는 염기서열 조각 개수(바이러스 리드)÷총 생산된 염기서열 조각 개수(저체 리드)×100. c)유전체 커버리지=리드서열이 커버하는 전체 바이러스 유전체에 대한 비율. d)커버리지 정도=유전체의 특정 위치에서 평균적으로 얼마나 많은 염기서열 조각이 중첩되었는지 나타내는 지표..

위와 같은 결과를 바탕으로 전장유전체 분석에 활용되는 검체는 바이러스 양이 확인된 가피, 피부병변을 우선하고, 액상 혼성화 시퀀싱 방법을 우선하였다. 이 결과, 전장유전체 분석은 2022년 6월부터 11월까지 국내에서 발생한 양성 환자의 검체 중 105개를 진행하였고, 완성된 일부 30개 전장유전체를 공공 유전체 데이터베이스에 공개하고 있다(표 2). NextClade를 이용한 유전체 계통을 분석한 결과, 국내에서 보고된 전장유전체의 계통이 전 세계에서 유행 중인 클레이드 IIb 중 리니지 B.1.1, A.2.1, C.1 등으로 분류되며, 이 중 2023년에 발생한 바이러스는 모두 리니지 C.1인 것으로 확인되었다. Nextstrain 사용한 유전체 계통학적 분석 결과에서도 위와 같은 결과를 확인하였다. 또한 변이분석을 위하여 CGW를 사용하여 참조유전체 서열(NC_063383.1)을 기준으로 전장유전체를 비교한 결과, 뉴클레오티드 변이가 74–86개, 아미노산 변이는 28–41개로 확인되었으며, APOBEC3 효소에 의한 변이가 80%로 확인되었다. 질병관리청에서 엠폭스 진단분석에 사용되는 A38R, F3L 유전자 부위에서의 변이는 현재까지 발견되지 않아 진단에 영향을 주지는 않는 것으로 확인되었다.

국내 발생 MPXV 전장유전체 등재현황(GenBank)
ID수집일클레이드리니지GenBank 등록번호
MPXV-ROK-P1-20222022-06-22IIbB.1.1OP204857
MPXV-ROK-P002-20222022-09-02IIbB.1.1OR459775
MPXV-ROK-P003-20222022-11-15IIbA.2.1OR459776
MPXV-ROK-P004-20222022-11-22IIbA.2.1OR459777
MPXV-ROK-P005-20232023-03-13IIbC.1OR459778
MPXV-ROK-P006-20232023-04-06IIbC.1OR459779
MPXV-ROK-P007-20232023-04-10IIbC.1OR459780
MPXV-ROK-P008-20232023-04-11IIbC.1OR459781
MPXV-ROK-P009-20232023-04-12IIbC.1OR459782
MPXV-ROK-P010-20232023-04-13IIbC.1OR459783
MPXV-ROK-P011-20232023-04-14IIbC.1OR459784
MPXV-ROK-P012-20232023-04-15IIbC.1OR459785
MPXV-ROK-P013-20232023-04-15IIbC.1OR459786
MPXV-ROK-P014-20232023-04-17IIbC.1OR459787
MPXV-ROK-P015-20232023-04-18IIbC.1OR459788
MPXV-ROK-P016-20232023-04-18IIbC.1OR459789
MPXV-ROK-P017-20232023-04-18IIbC.1OR459790
MPXV-ROK-P018-20232023-04-18IIbC.1OR459791
MPXV-ROK-P019-20232023-04-19IIbC.1OR459792
MPXV-ROK-P020-20232023-04-19IIbC.1OR459793
MPXV-ROK-P021-20232023-04-21IIbC.1OR459794
MPXV-ROK-P022-20232023-04-21IIbC.1OR459795
MPXV-ROK-P024-20232023-04-21IIbC.1OR459796
MPXV-ROK-P026-20232023-04-22IIbC.1OR459797
MPXV-ROK-P027-20232023-04-22IIbC.1OR459798
MPXV-ROK-P028-20232023-04-22IIbC.1OR459799
MPXV-ROK-P029-20232023-04-23IIbC.1OR459800
MPXV-ROK-P030-20232023-04-23IIbC.1OR459801
MPXV-ROK-P032-20232023-04-25IIbC.1OR459802
MPXV-ROK-P033-20232023-04-25IIbC.1OR459803
MPXV-ROK-P034-20232023-04-25IIbC.1OR459804

클레이드=공통의 조상에서 진화한 생물의 그룹. MPXV의 경우, 기존의 중앙아프리카 지역의 콩고-바신 바이러스를 클레이드 I으로, 서아프리카 지역의 바이러스는 클레이드 II로 나뉨; 리니지(Lineage)=공통의 조상에서 파생된 유전적으로 밀접한 관련성을 가지는 바이러스 그룹. 클레이드, 서브클레이드, 리니지 순으로 세분화됨. MPXV의 경우, A.1, B.1, C.1 등으로 세부적으로 리니지가 나뉨; Genbank 등록번호=공공 유전체 데이터베이스(GenBank)에서 부여한 등록번호; MPXV=원숭이두창 바이러스(monkeypox virus)..

논 의

본 연구에서는 NGS 기술과 생물정보분석 기술을 활용하여 2022년 5월부터 2023년 11월까지 국내에서 발생한 엠폭스 양성환자의 검체에서 MPXV의 전장유전체 정보를 성공적으로 분석하였다. 또한 액상 혼성화 시퀀싱 도입을 통해 MPXV의 유전체 리드 생산을 효과적으로 개선하였다. 전장유전체 분석 결과에 따르면 2022년 해외유입 MPXV는 리니지 B.1.1, A.2.1에 속하고, 2023년 5월부터 11월까지 국내 발생 MPXV는 리니지 C.1에 속하였다. 이는 해외에서 유입한 리니지 C.1의 MPXV가 국내 지역사회로 전파되고 있다는 가능성을 시사한다. 국내뿐 아니라 인접 국가인 일본, 중국, 대만에서 MPXV 리니지 C.1이 유행하고 있으므로 향후 국내에서 발생하는 MPXV도 같은 리니지일 가능성이 높다.

이러한 결과는 국내 MPXV의 유전체 감시의 일부분이며 향후 감염병 대응 및 예방을 위한 유전정보의 기초자료로 활용될 것으로 기대된다. 특히, 액상 혼성화 시퀀싱의 도입은 MPXV의 효율적인 분석을 가능하게 하였으며 이는 미래에 발생할 수 있는 다양한 감염병에 대한 대응 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이다.

또한 전장유전체 분석은 역학적으로 누락된 정보를 보완하고 이러한 미싱링크를 유전체적 유사성과 변이 패턴을 통해 간접적으로 파악이 가능하다. 특정 지역에서 발생한 감염 사례에서 비교유전체 분석을 실시함으로써 해외 유입된 병원체의 기원을 추정할 수 있으며, 또한 지역 사회 전파의 경우에는 지역 내 다른 환자들로부터 분리된 병원체의 유전적 유사성을 분석하여 공통된 감염 경로를 찾아낼 수 있다.

그러나 이 연구는 제한된 환자 수와 시간 범위 내에서 수행되었으며, 국내 및 국제적으로 발생 가능한 백신과 치료제에 대한 내성변이, 재조합이나 변이로 인한 병원성이나 감염성의 증가와 관련된 변이 등을 포함하여 MPXV의 다양한 변이를 다루지 못했다는 점에서 한계가 있다. 따라서 보다 많은 국내 MPXV에 대한 지역전파 클러스터 분석과 더불어 치료제에 대한 내성변이 추적, 유전자 재조합 및 변이에 따른 병원성과 감염성 분석 등의 추가적인 연구가 필요하며, 국제적인 협력을 통해 MPXV의 다양한 유전체와 변이에 대한 더 광범위한 이해를 도모할 필요가 있다. 이러한 연구는 전 세계적으로 언제든 다시 발생할 수 있는 엠폭스 감염병의 대응 및 예방을 위해 신속한 병원체 진단, 백신 및 치료제 연구와 개발, 새로운 변이에 대한 긴급 대응 및 예방 전략 수립, 더 나은 전략을 제안하는 데 기여할 것으로 기대한다.

Declarations

Funding Source: None.

Acknowledgments: None.

Ethics Statement: None.

Conflict of Interest: The authors have no conflicts of interest to declare.

Author Contributions: Conceptualization: YSC, CHC, MJL. Resources: MJL, JWK, CHC, HCS, MMC. Supervision: YSC. Writing – original draft: CHC, MJL. Writing – review & editing: all authors.

검체별 메타지노믹 시퀀싱과 액상 혼성화 시퀀싱 분석 방법에 따른 바이러스 리드 비교
ID검체(CT값a))메타지노믹 시퀀싱액상 혼성화 시퀀싱
바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)바이러스 리드 비율b)유전체 커버리지c)/커버리지 정도d)
MPXV-ROK-P002-2022구인두도말(34.81)0.5% (123,258/21,578,224)65%/12X83% (248,504/297,732)100%/166X
MPXV-ROK-P003-2022피부병변(23.11)5% (241,032/4,282,341)100%/225X98% (13,562,486/13,826,110)100%/8,860X
MPXV-ROK-P003-2022가피(26.35)11% (602,146/5,616,046)100%/600XN/AN/A
MPXV-ROK-P003-2022구인두도말(27.53)0.7% (34,894/4,919,884)99%/10XN/AN/A

a)CT값=threshold of cycle, CT값은 주로 어떤 유전자에 대한 DNA 또는 RNA의 양을 나타내는 지표로 CT값이 낮을수록 유전자나 시험 대상의 양이 많이 포함되어 있음. b)바이러스 리드 비율=바이러스 유전체에 해당하는 염기서열 조각 개수(바이러스 리드)÷총 생산된 염기서열 조각 개수(저체 리드)×100. c)유전체 커버리지=리드서열이 커버하는 전체 바이러스 유전체에 대한 비율. d)커버리지 정도=유전체의 특정 위치에서 평균적으로 얼마나 많은 염기서열 조각이 중첩되었는지 나타내는 지표..
국내 발생 MPXV 전장유전체 등재현황(GenBank)
ID수집일클레이드리니지GenBank 등록번호
MPXV-ROK-P1-20222022-06-22IIbB.1.1OP204857
MPXV-ROK-P002-20222022-09-02IIbB.1.1OR459775
MPXV-ROK-P003-20222022-11-15IIbA.2.1OR459776
MPXV-ROK-P004-20222022-11-22IIbA.2.1OR459777
MPXV-ROK-P005-20232023-03-13IIbC.1OR459778
MPXV-ROK-P006-20232023-04-06IIbC.1OR459779
MPXV-ROK-P007-20232023-04-10IIbC.1OR459780
MPXV-ROK-P008-20232023-04-11IIbC.1OR459781
MPXV-ROK-P009-20232023-04-12IIbC.1OR459782
MPXV-ROK-P010-20232023-04-13IIbC.1OR459783
MPXV-ROK-P011-20232023-04-14IIbC.1OR459784
MPXV-ROK-P012-20232023-04-15IIbC.1OR459785
MPXV-ROK-P013-20232023-04-15IIbC.1OR459786
MPXV-ROK-P014-20232023-04-17IIbC.1OR459787
MPXV-ROK-P015-20232023-04-18IIbC.1OR459788
MPXV-ROK-P016-20232023-04-18IIbC.1OR459789
MPXV-ROK-P017-20232023-04-18IIbC.1OR459790
MPXV-ROK-P018-20232023-04-18IIbC.1OR459791
MPXV-ROK-P019-20232023-04-19IIbC.1OR459792
MPXV-ROK-P020-20232023-04-19IIbC.1OR459793
MPXV-ROK-P021-20232023-04-21IIbC.1OR459794
MPXV-ROK-P022-20232023-04-21IIbC.1OR459795
MPXV-ROK-P024-20232023-04-21IIbC.1OR459796
MPXV-ROK-P026-20232023-04-22IIbC.1OR459797
MPXV-ROK-P027-20232023-04-22IIbC.1OR459798
MPXV-ROK-P028-20232023-04-22IIbC.1OR459799
MPXV-ROK-P029-20232023-04-23IIbC.1OR459800
MPXV-ROK-P030-20232023-04-23IIbC.1OR459801
MPXV-ROK-P032-20232023-04-25IIbC.1OR459802
MPXV-ROK-P033-20232023-04-25IIbC.1OR459803
MPXV-ROK-P034-20232023-04-25IIbC.1OR459804

클레이드=공통의 조상에서 진화한 생물의 그룹. MPXV의 경우, 기존의 중앙아프리카 지역의 콩고-바신 바이러스를 클레이드 I으로, 서아프리카 지역의 바이러스는 클레이드 II로 나뉨; 리니지(Lineage)=공통의 조상에서 파생된 유전적으로 밀접한 관련성을 가지는 바이러스 그룹. 클레이드, 서브클레이드, 리니지 순으로 세분화됨. MPXV의 경우, A.1, B.1, C.1 등으로 세부적으로 리니지가 나뉨; Genbank 등록번호=공공 유전체 데이터베이스(GenBank)에서 부여한 등록번호; MPXV=원숭이두창 바이러스(monkeypox virus)..

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