연구논문

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Public Health Weekly Report 2023; 16(44): 1491-1503

Published online October 13, 2023

https://doi.org/10.56786/PHWR.2023.16.44.1

© The Korea Disease Control and Prevention Agency

샌드위치 효소면역분석법을 이용한 보툴리눔독소증 실험실 검사법 개발

최은선1, 김소현1, 전준호2, 이화중1, 정윤석1*

1질병관리청 감염병진단분석국 고위험병원체분석과, 2질병관리청 충청권질병대응센터 진단분석과

*Corresponding author: 정윤석, Tel: +82-43-719-8270, E-mail: rollstone93@korea.kr

Received: September 11, 2023; Revised: October 10, 2023; Accepted: October 11, 2023

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

보툴리눔독소증은 이완성 신경마비 질환으로, 포자를 생성하는 그람양성의 혐기성 세균인 보툴리눔 균(Clostridium botulinum)에서 생성하는 강력한 신경독소에 의해 유발된다. 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 보툴리눔 독소를 진단하는 국제 표준검사법으로 사용하고 있지만, 실험동물 사용으로 인한 윤리적인 문제와 결과가 확인될 때까지 긴 시간이 소요되어 신속하고 정확한 검사법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 보툴리눔 독소에 대한 생물테러 또는 보툴리눔독소증 자연발생 시 신속한 진단을 위해 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였다. 키트의 성능을 평가하기 위해 정상 사람 혈청에 독소를 첨가하여 민감도, 정밀도 및 특이도 검사를 수행하였다. 그 결과 독소 A와 B의 최소 검출한계는 각각 0.153 ng/ml와 0.027 ng/ml로 확인되었고, 키트 내, 키트 간, 실험자 간 반복성 및 재현성을 확인한 결과, 변동계수는 10% 미만으로 확인되었다. 특이도 실험에서는 다른 독소(보툴리눔 독소 E형, 파상풍독소, 황색포도알균 장독소 B형)에는 반응하지 않고 보툴리눔 독소 A와 B를 특이적으로 검출함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트가 높은 민감도와 특이도를 가지며, 표준검사법과 유사한 수준으로 보툴리눔 독소의 검출과 모니터링에 유용한 도구로 활용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 또한 보툴리눔독소증 의심 환자 검체에서 보툴리눔 독소를 신속하게 검출하여 치료방향에 대한 과학적 근거를 제시하는 효과적인 검사법으로 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.

Keywords 보툴리눔독소증, 보툴리눔 독소, 샌드위치 효소면역분석법, 마우스 바이오어세이

핵심요약

① 이전에 알려진 내용은?

보툴리눔독소증을 진단하기 위한 마우스 바이오어세이 검사법은 gold standard로 민감도 및 정확도가 높지만 실험동물 마우스를 사용하기 때문에 윤리적인 문제가 있으며, 마우스가 독소에 의한 병증 또는 사망하여 독소증을 확인하는 데 최소 4일의 시간이 소요됨으로 보다 신속한 검사법 개발이 필요하다.

② 새로이 알게 된 내용은?

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트는 민감도, 정밀도, 특이도 검사에서 사람 혈청에 희석되어 있는 독소를 높은 민감도로 검출하였고, 반복성 및 재현성이 확인되었으며 보툴리눔 독소만 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.

③ 시사점은?

샌드위치 ELISA뿐만 아니라 보다 신속하게 보툴리눔독소증을 진단할 수 있는 검사법의 개발을 위한 지속적인 노력이 필요하다.

보툴리눔 균(Clostridium botulinum)은 절대 혐기성의 그람양성 간균으로 토양과 물에서 발견되며, 혈청학적으로 A–G까지 7가지 독소를 생성한다. 이 중 독소 A, B, E와 F형에 의해 인간 보툴리눔독소증(botulism)이 유발되고, 이완성 신경마비 및 호흡곤란 등 심각한 증상을 초래한다[1]. 보툴리눔 독소는 지구상에 알려진 가장 강력한 독성물질로 보고되고 있으며, 미국질병통제예방센터(U.S. Centers for Disease Control and Prevention)에서는 생물테러에 가장 위험한 카테고리 A 물질로 분류하고 있다[2]. 국내에서는 2002년부터 보툴리눔독소증을 제4군 법정감염병으로 지정하였고 2010년, 감염병의 예방과 관리에 관한 법률이 개정됨에 따라 보툴리눔 균이 생물테러에 악용될 수 있는 ‘고위험병원체’로 지정되어 병원체 관리와 보툴리눔독소증 환자 발생에 대한 감시 및 실험실 진단이 한층 강화되었다[3]. 보툴리눔독소증 환자는 전 세계적으로 드물지만 매년 지속적으로 발생하고 있다. 미국의 경우, 한 해 동안 100명에서 200명 이상의 환자가 발생하고 있고 발생 환자의 45% 이상에서 A와 B형 독소가 검출되었다[4]. 우리나라의 경우 2003년부터 2023년까지 총 11명의 보툴리눔독소증 환자가 발생하였으며 환자의 30% 이상이 A와 B형 보툴리눔 독소에 감염된 것으로 확인되었다[5]. 보툴리눔독소증 실험실 진단법으로 사용되는 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 동물을 이용하여 4가지 독소형(A, B, E, F)을 민감하게 검출할 수 있는 표준검사법(gold standard)으로, 20 pg/ml 농도의 보툴리눔 독소를 검출할 수 있을 정도로 매우 민감한 검사법이다[6]. 그러나 검사를 위해 최소 4일의 시간이 소요되기 때문에 보툴리눔독소증 의심 환자 발생 시 독소 노출 초기에 신속하게 진단함으로써 추가적인 피해를 최소화하기 위한 진단검사법이 필요하다. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)는 감염병 병원체의 단백질뿐만 아니라 독소형 확인 및 독소 정량을 위하여 가장 널리 사용되는 in vitro 검사법 중 하나로 항원-항체 결합을 기반으로 하는 검사법이다. 그 중 샌드위치 ELISA법은 독소 검출을 위하여 보툴리눔 독소의 특이적인 capture와 detection 항체를 사용하며 독소를 민감하게 검출할 수 있다. 본 연구에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B를 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였고 이를 실제 검체 등으로 검증하여 향후 표준검사법을 보완하기 위한 검사법으로 활용하고자 한다.

1. 개요

질병관리청 고위험병원체분석과에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B의 샌드위치 ELISA 키트를 자체 제작하여 보툴리눔독소증 실험실 검사에 사용하고자 하였다. 이 키트는 보툴리눔 독소 A와 B를 각각 검출할 수 있는 특이 항체인 단클론 항체와 다클론 항체를 제작하여 사용하였고, 독소 검출 민감도를 높이기 위해 비오틴-스트렙타비딘의 상호작용을 활용하는 방법으로 다클론 항체에 비오틴을 표지하였다. 샌드위치 ELISA 키트를 검증하기 위해 수행한 민감도, 정밀도 및 특이도 검사는 1:100으로 희석된 human serum (Sigma Aldrich) 제품에 보툴리눔 독소(Metabiologics)를 첨가하여 검체로 사용하였다.

2. 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 및 단클론 항체 제작

1) 다클론 항체 제작

보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체 제작을 위해 New Zealand white 토끼를 이용하여 2주 간격으로 alkylation 또는 formalin으로 불활화된 독소 A와 B (항원) 100 μg을 각각 토끼 피하에 3회 면역하였다. 1차 면역은 complete freund’s adjuvant와 항원, 2차 면역은 incomplete freund’s adjuvant와 항원을, 그리고 3차 면역은 면역 보조제 없이 항원만 면역하였다. 3회 면역 후 토끼 혈청에서 항체를 분리하였고, ELISA를 이용하여 보툴리눔 독소 A 또는 B 항원에 대한 항체가를 확인하였다. 항체가가 확인된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체는 비오틴을 표지하여 각 키트의 detection 항체로 사용하였다.

2) 단클론 항체 제작

(1) 보툴리눔 부분독소 A 또는 B 항원 제작

보툴리눔 독소 A 또는 B 중쇄의 C-terminal receptor binding domain (HCCA 또는 HCCB)을 암호화하는 염기서열을 각각 화학 합성하여 제작한 후 pET19b벡터에 삽입하여 클로닝하였다. pET19b-HCCA 또는 pET19b-HCCB DNA는 E. coli BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환 후, 균에서 HCCA 단백질을 분리 및 정제하였다.

(2) 보툴리눔 독소 A 또는 B 단클론 항체 제작

단클론 항체 제작을 위해 분리 및 정제한 항원 HCCA 또는 HCCB는 마우스 발바닥에 각각 100 μg씩 1주 간격으로 3–4회 동일 양을 면역하였다. 면역 완료 후 마우스 혈청 내 ELISA titer 값이 높은 마우스를 선별하여 림프절에서 림프구를 분리하고 sp2/0 myeloma 세포와 융합시켰다. 선택배지를 이용하여 융합된 세포를 선별하고 ELISA를 통해 흡광도 값이 높은 보툴리눔 독소 A 단클론 항체 22B3과 보툴리눔 독소 B 단클론 항체 19B7 생산 세포를 선별하였다. 선별된 세포에서 생산된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 단클론 항체는 각 키트의 capture 항체로 사용하였다.

3. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 검사법

보툴리눔 독소 A 또는 B capture 항체는 96 well-microtiter plate에 각각 2.5 μg/ml (22B3)와 1 μg/ml (19B7)의 농도로 코팅하여 37℃에서 1시간 동안 고정시켰다(그림 1A). 세척액(0.05% Tween-20이 함유된 phosphate-buffered saline [PBS])으로 5회 세척 후, 1% bovine serum albumin이 함유된 PBS로 1시간 차단시켰고(그림 1B), 세척액으로 5회 세척한 후 1:100 human serum에 보툴리눔 독소 A 또는 B를 5 ng/ml부터 2배씩 단계 희석하여 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다(그림 1C). 세척한 후 비오틴이 표지된 detection 항체를 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨다(그림 1D). 세척 후 스트렙타비딘-horseradish peroxidase를 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨다(그림 1E). 마지막으로 5회 세척한 후 기질용액(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 100 μl씩 plate well에 넣고 실온에서 5분간 반응시킨다(그림 1F). 반응정지용액(2N H2SO4)을 넣고 반응을 정지시키고 plate reader 기계에 흡광도 450 nm로 결과값을 측정한다.

Figure. 1.보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 검사법 도식화
(A) Capture 항체를 플레이트에 코팅. (B) 플레이트 차단. (C) 항원샘플 추가. (D) 비오틴이 표지된 detection 항체 추가. (E) 스트렙타비딘-HRP 접합체 추가. (F) 기질용액에 의한 효소-기질 반응. HRP=horseradish peroxidase.

4. 분석방법

1) 분석적 민감도

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 사람혈청에 희석된 독소 검체를 24회 반복 실험하여 최소 검출 한계 값을 측정하였다. 보툴리눔 독소 최소검출한계(limit of detection) 값은 측정된 blank 값의 표준편차(standard deviation, STDEV) 3배 값과 blank 평균(average, AVG)값을 더하여 계산하였고(AVG+3×STDEV), 이 값을 검량선과 수식 그래프에 대입하여 본 ELISA 키트로 검사 시 양성으로 판정 가능한 독소의 최소 검출 가능 농도로 계산하였다.

2) 정밀도

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 동일한 분석 조건으로 키트 내 12회 반복(intra-assay), 6일 동안 각 키트를 2회씩 반복(inter-assay), 2명의 실험자가 3일 동안 매일 키트 2회 반복(intermediate-assay) 실험으로 반복성 및 재현성을 확인하였다. 변동계수(coefficient of variation) 값은 표준오차(standard error of mean)에 보툴리눔 독소 평균 측정값을 나누어 백분율로 환산하고, 가용기준은 10% 미만으로 하였다.

3) 특이도

다양한 독소(보툴리눔 독소 E형, 파상풍 독소, 황색포도알균 장독소 B형) 0.5 μg/ml를 이용하여 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도를 측정하였다.

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 민감도 검사결과, 사람 혈청에 첨가된 독소 A와 B에 대한 최소 검출한계 값(평균 흡광도)은 각각 0.104와 0.117로 확인되었고, 최소 검출가능 독소 농도는 각각 0.153 ng/ml와 0.027 ng/ml의 결과를 확인하였다(표 1). 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트는 pg/ml 단위의 낮은 농도에서도 독소가 검출되어 우수한 민감도를 확인할 수 있었다.

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 민감도 측정

샌드위치 ELISA 키트최소 검출한계 값(평균 흡광도)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)
보툴리눔 독소 A0.1040.153
보툴리눔 독소 B0.1170.027


보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA의 최소 검출한계 값 반복성 및 재현성을 확인하기 위해 정밀도 검사를 수행하였다. 실험 결과 변동계수가 10% 미만으로 결과 값의 낮은 표준편차를 확인하였고, 최소 검출한계 값은 샌드위치 ELISA 키트 내, 키트 간, 실험자 간의 반복성 및 재현성을 검증 할 수 있었다(표 2). 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도 검사에서는 다양한 독소(보툴리눔 독소 A, B, E형, 파상풍독소, 황색포도알균장독소 B형) 0.5 μg/ml를 사람 혈청에 희석하여 측정한 결과, 양성대조군으로 사용된 각 키트의 해당 독소(A 또는 B)를 제외하고 다른 독소는 검출되지 않음을 확인하였다(표 3). 이 결과 샌드위치 ELISA 키트는 보툴리눔 독소 A 또는 B를 특이적으로 검출하고, 다른 독소와 교차반응 하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 정밀도 측정

정밀도 검사보툴리눔 독소 A 키트보툴리눔 독소 B 키트
최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)
키트 내 반복성0.1667.80.03310.4
키트 간 반복성0.1327.20.0181.6
실험자 간 재현성0.274.10.0153.3


다양한 독소(0.5 μg/ml)를 이용한 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도 측정

키트독소평균 흡광도±표준편차결과자료 및 참조
보툴리눔 독소 A 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 A1.421±0.309+Metabiologics
보툴리눔 독소 B0.214±0.002Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.147±0.022Metabiologics
파상풍 독소0.118±0.016Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소 B
0.130±0.007Sigma Aldrich
사람 혈청0.143±0.062Sigma Aldrich
보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 B2.912±0.062+Metabiologics
보툴리눔 독소 A0.179±0.014Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.060±0.003Metabiologics
파상풍 독소0.060±0.001Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소B
0.060±0.000Sigma Aldrich
사람 혈청0.122±0.012Sigma Aldrich


본 연구에서는 보툴리눔 독소 A와 B를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였고, 사람 혈청에 희석되어 있음에도 불구하고 0.3 ng/ml 미만의 최소 검출한계 독소 농도를 측정할 수 있었다. 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트의 경우 15 pg/ml 이하에서도 독소 검출이 가능한 것을 확인하였다. 이는 마우스 바이오어세이 검사법에서 검출할 수 있는 농도인 20 pg/ml보다 낮은 수준으로, 향후 마우스 바이오어세이의 단점을 보완하고 대체할 수 있는 검사법으로 적용이 가능하다고 생각된다.

현재까지 보툴리눔독소증 실험실 검사를 위해서 전 세계적으로 마우스 바이오어세이를 표준검사법으로 활용하고 있다. 마우스 바이오어세이는 보툴리눔독소증 여부 확인을 위해 최대 4일이 필요하며 동물의 희생을 필요로 하기 때문에 이를 대체하기 위한 다양한 검사법이 연구되어 왔다. 질병관리청에서는 마우스 바이오어세이와 함께 보툴리눔 독소 A, B, E 그리고 F형의 유전자를 각각 검출하는 real-time polymerase chain reaction 검사법을 병행하여 더 정확한 실험실 검사법을 구축하고 있다. 이 검사법은 보툴리눔독소증 의심환자 검체에서 균을 분리하여 유전자 추출 후, 보툴리눔 독소형을 확인하는 것으로 정확한 진단을 위한 균 배양에는 최소 10일 정도의 검사시간이 소요된다. 보툴리눔독소증을 진단하기 위한 가장 빠른 검사법 중, 측면유동면역검사법(lateral flow immunoassay)은 면역크로마토그래피 검사법의 하나로 시료를 떨어뜨려 항원-항체 결합반응에 의한 면역복합체가 모세관현상에 의해 멤브레인을 이동하여 15분 이내에 밴드를 확인할 수 있는 신속한 검사법이다. 검출한계는 5–50 ng/ml로 알려져 있다[7]. 본 연구에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트 검사에서 사람 혈청에 첨가된 독소 A와 B를 검출할 수 있는 최소한계 값을 0.3 ng/ml 이하로 확인하였다. 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트 검사에서는 독소 B형을 15 pg/ml까지 검출할 수 있었고, 이 결과는 마우스 바이오어세이 검사법보다 더 높은 민감도(20 pg/ml)를 보였다. 또한 이 두 키트는 보툴리눔 독소 E형, 파상풍 독소, 황색포도알균 장독소 B형과 같은 다른 독소에 의한 교차반응 없이 보툴리눔 독소 A 또는 B만을 검출하는 높은 특이도를 확인하였다.

향후 보툴리눔 독소 A 샌드위치 ELISA 키트는 독소의 민감도를 높이기 위한 추가 연구를 수행하여 최소 검출한계 값을 개선하고 검증할 예정이다. 이 키트에 사용된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 특이적인 항체(22B3, 19B7)는 특허로 출원된 상태이며, 진단뿐만 아니라 독소를 중화시키는 항체 치료제로 연구에 사용할 수 있으며, 실제로 마우스 실험에서 높은 중화능을 확인한 바 있다. 따라서 본 연구에서 개발한 보툴리눔 독소 샌드위치 ELISA 키트는 검사에 최소 4일 이상이 걸리는 마우스 바이오어세이 및 균 배양검사법의 단점을 보완하여 보툴리눔독소증 환자 집단 발생 시, 혈청 검체를 이용해 최대 1일 이내에 독소형 및 독소량을 확인할 수 있으며 위급한 환자에게 신속한 치료의 방향을 제시하여 적절한 치료제를 사용할 과학적 근거를 제공할 수 있을 것이다.

Acknowledgments: None.

Ethics Statement: Not applicable.

Funding Source: Korea Disease Control and Prevention Agency, 4840-302-210-13.

Conflict of Interest: The authors have no conflicts of interest to declare.

Author Contributions: Conceptualization: JHJ. Data curation: ESC, SHK. Formal analysis: ESC, SHK. Funding acquisition: JHJ. Investigation: ESC. Methodology: ESC. Project administration: JHJ, SHK. Supervision: YSC, HJY. Validation: CES. Writing – original draft: ESC, SHK. Writing – review & editing: YSC, HJY, SHK.

  1. Cheng LW, Land KM, Stanker LH. Current methods for detecting the presence of botulinum neurotoxins in food and other biological samples. In: Morse S, editor. Bioterrorism. InTech; 2012. p.1-16.
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  2. Dembek ZF, Smith LA, Rusnak JM. Botulinum toxin. In: Dembek ZF, editor. Medical aspects of biological warfare. Office of the Surgeon General; 2007. p.337-53.
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  3. Kim YH, Shin NR, Cha K, Rhie GE, Kang SJ. Laboratory diagnosis of botulism. Public Health Wkly Rep 2014;7:857-64.
  4. National botulism surveillance summary, 2008-2019 [Internet]. Centers for Disease Control and Prevention [cited 2023 Aug 25].
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  6. Stanker LH, Merrill P, Scotcher MC, Cheng LW. Development and partial characterization of high-affinity monoclonal antibodies for botulinum toxin type A and their use in analysis of milk by sandwich ELISA. J Immunol Methods 2008;336:1-8.
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  7. Ozanich RM, Baird CL, Bartholomew RA, Colburn HA, Straub TM, Bruckner-Lea CJ. Biodetection technologies for first responders. 2014 ed. Pacific Northwest National Laboratory; 2014.
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Article

연구논문

Public Health Weekly Report 2023; 16(44): 1491-1503

Published online November 16, 2023 https://doi.org/10.56786/PHWR.2023.16.44.1

Copyright © The Korea Disease Control and Prevention Agency.

샌드위치 효소면역분석법을 이용한 보툴리눔독소증 실험실 검사법 개발

최은선1, 김소현1, 전준호2, 이화중1, 정윤석1*

1질병관리청 감염병진단분석국 고위험병원체분석과, 2질병관리청 충청권질병대응센터 진단분석과

Received: September 11, 2023; Revised: October 10, 2023; Accepted: October 11, 2023

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

보툴리눔독소증은 이완성 신경마비 질환으로, 포자를 생성하는 그람양성의 혐기성 세균인 보툴리눔 균(Clostridium botulinum)에서 생성하는 강력한 신경독소에 의해 유발된다. 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 보툴리눔 독소를 진단하는 국제 표준검사법으로 사용하고 있지만, 실험동물 사용으로 인한 윤리적인 문제와 결과가 확인될 때까지 긴 시간이 소요되어 신속하고 정확한 검사법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 보툴리눔 독소에 대한 생물테러 또는 보툴리눔독소증 자연발생 시 신속한 진단을 위해 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였다. 키트의 성능을 평가하기 위해 정상 사람 혈청에 독소를 첨가하여 민감도, 정밀도 및 특이도 검사를 수행하였다. 그 결과 독소 A와 B의 최소 검출한계는 각각 0.153 ng/ml와 0.027 ng/ml로 확인되었고, 키트 내, 키트 간, 실험자 간 반복성 및 재현성을 확인한 결과, 변동계수는 10% 미만으로 확인되었다. 특이도 실험에서는 다른 독소(보툴리눔 독소 E형, 파상풍독소, 황색포도알균 장독소 B형)에는 반응하지 않고 보툴리눔 독소 A와 B를 특이적으로 검출함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트가 높은 민감도와 특이도를 가지며, 표준검사법과 유사한 수준으로 보툴리눔 독소의 검출과 모니터링에 유용한 도구로 활용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 또한 보툴리눔독소증 의심 환자 검체에서 보툴리눔 독소를 신속하게 검출하여 치료방향에 대한 과학적 근거를 제시하는 효과적인 검사법으로 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.

Keywords: 보툴리눔독소증, 보툴리눔 독소, 샌드위치 효소면역분석법, 마우스 바이오어세이

서 론

핵심요약

① 이전에 알려진 내용은?

보툴리눔독소증을 진단하기 위한 마우스 바이오어세이 검사법은 gold standard로 민감도 및 정확도가 높지만 실험동물 마우스를 사용하기 때문에 윤리적인 문제가 있으며, 마우스가 독소에 의한 병증 또는 사망하여 독소증을 확인하는 데 최소 4일의 시간이 소요됨으로 보다 신속한 검사법 개발이 필요하다.

② 새로이 알게 된 내용은?

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트는 민감도, 정밀도, 특이도 검사에서 사람 혈청에 희석되어 있는 독소를 높은 민감도로 검출하였고, 반복성 및 재현성이 확인되었으며 보툴리눔 독소만 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.

③ 시사점은?

샌드위치 ELISA뿐만 아니라 보다 신속하게 보툴리눔독소증을 진단할 수 있는 검사법의 개발을 위한 지속적인 노력이 필요하다.

보툴리눔 균(Clostridium botulinum)은 절대 혐기성의 그람양성 간균으로 토양과 물에서 발견되며, 혈청학적으로 A–G까지 7가지 독소를 생성한다. 이 중 독소 A, B, E와 F형에 의해 인간 보툴리눔독소증(botulism)이 유발되고, 이완성 신경마비 및 호흡곤란 등 심각한 증상을 초래한다[1]. 보툴리눔 독소는 지구상에 알려진 가장 강력한 독성물질로 보고되고 있으며, 미국질병통제예방센터(U.S. Centers for Disease Control and Prevention)에서는 생물테러에 가장 위험한 카테고리 A 물질로 분류하고 있다[2]. 국내에서는 2002년부터 보툴리눔독소증을 제4군 법정감염병으로 지정하였고 2010년, 감염병의 예방과 관리에 관한 법률이 개정됨에 따라 보툴리눔 균이 생물테러에 악용될 수 있는 ‘고위험병원체’로 지정되어 병원체 관리와 보툴리눔독소증 환자 발생에 대한 감시 및 실험실 진단이 한층 강화되었다[3]. 보툴리눔독소증 환자는 전 세계적으로 드물지만 매년 지속적으로 발생하고 있다. 미국의 경우, 한 해 동안 100명에서 200명 이상의 환자가 발생하고 있고 발생 환자의 45% 이상에서 A와 B형 독소가 검출되었다[4]. 우리나라의 경우 2003년부터 2023년까지 총 11명의 보툴리눔독소증 환자가 발생하였으며 환자의 30% 이상이 A와 B형 보툴리눔 독소에 감염된 것으로 확인되었다[5]. 보툴리눔독소증 실험실 진단법으로 사용되는 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 동물을 이용하여 4가지 독소형(A, B, E, F)을 민감하게 검출할 수 있는 표준검사법(gold standard)으로, 20 pg/ml 농도의 보툴리눔 독소를 검출할 수 있을 정도로 매우 민감한 검사법이다[6]. 그러나 검사를 위해 최소 4일의 시간이 소요되기 때문에 보툴리눔독소증 의심 환자 발생 시 독소 노출 초기에 신속하게 진단함으로써 추가적인 피해를 최소화하기 위한 진단검사법이 필요하다. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)는 감염병 병원체의 단백질뿐만 아니라 독소형 확인 및 독소 정량을 위하여 가장 널리 사용되는 in vitro 검사법 중 하나로 항원-항체 결합을 기반으로 하는 검사법이다. 그 중 샌드위치 ELISA법은 독소 검출을 위하여 보툴리눔 독소의 특이적인 capture와 detection 항체를 사용하며 독소를 민감하게 검출할 수 있다. 본 연구에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B를 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였고 이를 실제 검체 등으로 검증하여 향후 표준검사법을 보완하기 위한 검사법으로 활용하고자 한다.

방 법

1. 개요

질병관리청 고위험병원체분석과에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B의 샌드위치 ELISA 키트를 자체 제작하여 보툴리눔독소증 실험실 검사에 사용하고자 하였다. 이 키트는 보툴리눔 독소 A와 B를 각각 검출할 수 있는 특이 항체인 단클론 항체와 다클론 항체를 제작하여 사용하였고, 독소 검출 민감도를 높이기 위해 비오틴-스트렙타비딘의 상호작용을 활용하는 방법으로 다클론 항체에 비오틴을 표지하였다. 샌드위치 ELISA 키트를 검증하기 위해 수행한 민감도, 정밀도 및 특이도 검사는 1:100으로 희석된 human serum (Sigma Aldrich) 제품에 보툴리눔 독소(Metabiologics)를 첨가하여 검체로 사용하였다.

2. 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 및 단클론 항체 제작

1) 다클론 항체 제작

보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체 제작을 위해 New Zealand white 토끼를 이용하여 2주 간격으로 alkylation 또는 formalin으로 불활화된 독소 A와 B (항원) 100 μg을 각각 토끼 피하에 3회 면역하였다. 1차 면역은 complete freund’s adjuvant와 항원, 2차 면역은 incomplete freund’s adjuvant와 항원을, 그리고 3차 면역은 면역 보조제 없이 항원만 면역하였다. 3회 면역 후 토끼 혈청에서 항체를 분리하였고, ELISA를 이용하여 보툴리눔 독소 A 또는 B 항원에 대한 항체가를 확인하였다. 항체가가 확인된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체는 비오틴을 표지하여 각 키트의 detection 항체로 사용하였다.

2) 단클론 항체 제작

(1) 보툴리눔 부분독소 A 또는 B 항원 제작

보툴리눔 독소 A 또는 B 중쇄의 C-terminal receptor binding domain (HCCA 또는 HCCB)을 암호화하는 염기서열을 각각 화학 합성하여 제작한 후 pET19b벡터에 삽입하여 클로닝하였다. pET19b-HCCA 또는 pET19b-HCCB DNA는 E. coli BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환 후, 균에서 HCCA 단백질을 분리 및 정제하였다.

(2) 보툴리눔 독소 A 또는 B 단클론 항체 제작

단클론 항체 제작을 위해 분리 및 정제한 항원 HCCA 또는 HCCB는 마우스 발바닥에 각각 100 μg씩 1주 간격으로 3–4회 동일 양을 면역하였다. 면역 완료 후 마우스 혈청 내 ELISA titer 값이 높은 마우스를 선별하여 림프절에서 림프구를 분리하고 sp2/0 myeloma 세포와 융합시켰다. 선택배지를 이용하여 융합된 세포를 선별하고 ELISA를 통해 흡광도 값이 높은 보툴리눔 독소 A 단클론 항체 22B3과 보툴리눔 독소 B 단클론 항체 19B7 생산 세포를 선별하였다. 선별된 세포에서 생산된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 단클론 항체는 각 키트의 capture 항체로 사용하였다.

3. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 검사법

보툴리눔 독소 A 또는 B capture 항체는 96 well-microtiter plate에 각각 2.5 μg/ml (22B3)와 1 μg/ml (19B7)의 농도로 코팅하여 37℃에서 1시간 동안 고정시켰다(그림 1A). 세척액(0.05% Tween-20이 함유된 phosphate-buffered saline [PBS])으로 5회 세척 후, 1% bovine serum albumin이 함유된 PBS로 1시간 차단시켰고(그림 1B), 세척액으로 5회 세척한 후 1:100 human serum에 보툴리눔 독소 A 또는 B를 5 ng/ml부터 2배씩 단계 희석하여 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다(그림 1C). 세척한 후 비오틴이 표지된 detection 항체를 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨다(그림 1D). 세척 후 스트렙타비딘-horseradish peroxidase를 100 μl씩 plate well에 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨다(그림 1E). 마지막으로 5회 세척한 후 기질용액(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 100 μl씩 plate well에 넣고 실온에서 5분간 반응시킨다(그림 1F). 반응정지용액(2N H2SO4)을 넣고 반응을 정지시키고 plate reader 기계에 흡광도 450 nm로 결과값을 측정한다.

Figure 1. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 검사법 도식화
(A) Capture 항체를 플레이트에 코팅. (B) 플레이트 차단. (C) 항원샘플 추가. (D) 비오틴이 표지된 detection 항체 추가. (E) 스트렙타비딘-HRP 접합체 추가. (F) 기질용액에 의한 효소-기질 반응. HRP=horseradish peroxidase.

4. 분석방법

1) 분석적 민감도

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 사람혈청에 희석된 독소 검체를 24회 반복 실험하여 최소 검출 한계 값을 측정하였다. 보툴리눔 독소 최소검출한계(limit of detection) 값은 측정된 blank 값의 표준편차(standard deviation, STDEV) 3배 값과 blank 평균(average, AVG)값을 더하여 계산하였고(AVG+3×STDEV), 이 값을 검량선과 수식 그래프에 대입하여 본 ELISA 키트로 검사 시 양성으로 판정 가능한 독소의 최소 검출 가능 농도로 계산하였다.

2) 정밀도

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 동일한 분석 조건으로 키트 내 12회 반복(intra-assay), 6일 동안 각 키트를 2회씩 반복(inter-assay), 2명의 실험자가 3일 동안 매일 키트 2회 반복(intermediate-assay) 실험으로 반복성 및 재현성을 확인하였다. 변동계수(coefficient of variation) 값은 표준오차(standard error of mean)에 보툴리눔 독소 평균 측정값을 나누어 백분율로 환산하고, 가용기준은 10% 미만으로 하였다.

3) 특이도

다양한 독소(보툴리눔 독소 E형, 파상풍 독소, 황색포도알균 장독소 B형) 0.5 μg/ml를 이용하여 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도를 측정하였다.

결 과

보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 민감도 검사결과, 사람 혈청에 첨가된 독소 A와 B에 대한 최소 검출한계 값(평균 흡광도)은 각각 0.104와 0.117로 확인되었고, 최소 검출가능 독소 농도는 각각 0.153 ng/ml와 0.027 ng/ml의 결과를 확인하였다(표 1). 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트는 pg/ml 단위의 낮은 농도에서도 독소가 검출되어 우수한 민감도를 확인할 수 있었다.

표 1. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 민감도 측정.

샌드위치 ELISA 키트최소 검출한계 값(평균 흡광도)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)
보툴리눔 독소 A0.1040.153
보툴리눔 독소 B0.1170.027


보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA의 최소 검출한계 값 반복성 및 재현성을 확인하기 위해 정밀도 검사를 수행하였다. 실험 결과 변동계수가 10% 미만으로 결과 값의 낮은 표준편차를 확인하였고, 최소 검출한계 값은 샌드위치 ELISA 키트 내, 키트 간, 실험자 간의 반복성 및 재현성을 검증 할 수 있었다(표 2). 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도 검사에서는 다양한 독소(보툴리눔 독소 A, B, E형, 파상풍독소, 황색포도알균장독소 B형) 0.5 μg/ml를 사람 혈청에 희석하여 측정한 결과, 양성대조군으로 사용된 각 키트의 해당 독소(A 또는 B)를 제외하고 다른 독소는 검출되지 않음을 확인하였다(표 3). 이 결과 샌드위치 ELISA 키트는 보툴리눔 독소 A 또는 B를 특이적으로 검출하고, 다른 독소와 교차반응 하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

표 2. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 정밀도 측정.

정밀도 검사보툴리눔 독소 A 키트보툴리눔 독소 B 키트
최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)
키트 내 반복성0.1667.80.03310.4
키트 간 반복성0.1327.20.0181.6
실험자 간 재현성0.274.10.0153.3


표 3. 다양한 독소(0.5 μg/ml)를 이용한 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도 측정.

키트독소평균 흡광도±표준편차결과자료 및 참조
보툴리눔 독소 A 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 A1.421±0.309+Metabiologics
보툴리눔 독소 B0.214±0.002Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.147±0.022Metabiologics
파상풍 독소0.118±0.016Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소 B
0.130±0.007Sigma Aldrich
사람 혈청0.143±0.062Sigma Aldrich
보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 B2.912±0.062+Metabiologics
보툴리눔 독소 A0.179±0.014Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.060±0.003Metabiologics
파상풍 독소0.060±0.001Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소B
0.060±0.000Sigma Aldrich
사람 혈청0.122±0.012Sigma Aldrich


본 연구에서는 보툴리눔 독소 A와 B를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였고, 사람 혈청에 희석되어 있음에도 불구하고 0.3 ng/ml 미만의 최소 검출한계 독소 농도를 측정할 수 있었다. 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트의 경우 15 pg/ml 이하에서도 독소 검출이 가능한 것을 확인하였다. 이는 마우스 바이오어세이 검사법에서 검출할 수 있는 농도인 20 pg/ml보다 낮은 수준으로, 향후 마우스 바이오어세이의 단점을 보완하고 대체할 수 있는 검사법으로 적용이 가능하다고 생각된다.

논 의

현재까지 보툴리눔독소증 실험실 검사를 위해서 전 세계적으로 마우스 바이오어세이를 표준검사법으로 활용하고 있다. 마우스 바이오어세이는 보툴리눔독소증 여부 확인을 위해 최대 4일이 필요하며 동물의 희생을 필요로 하기 때문에 이를 대체하기 위한 다양한 검사법이 연구되어 왔다. 질병관리청에서는 마우스 바이오어세이와 함께 보툴리눔 독소 A, B, E 그리고 F형의 유전자를 각각 검출하는 real-time polymerase chain reaction 검사법을 병행하여 더 정확한 실험실 검사법을 구축하고 있다. 이 검사법은 보툴리눔독소증 의심환자 검체에서 균을 분리하여 유전자 추출 후, 보툴리눔 독소형을 확인하는 것으로 정확한 진단을 위한 균 배양에는 최소 10일 정도의 검사시간이 소요된다. 보툴리눔독소증을 진단하기 위한 가장 빠른 검사법 중, 측면유동면역검사법(lateral flow immunoassay)은 면역크로마토그래피 검사법의 하나로 시료를 떨어뜨려 항원-항체 결합반응에 의한 면역복합체가 모세관현상에 의해 멤브레인을 이동하여 15분 이내에 밴드를 확인할 수 있는 신속한 검사법이다. 검출한계는 5–50 ng/ml로 알려져 있다[7]. 본 연구에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트 검사에서 사람 혈청에 첨가된 독소 A와 B를 검출할 수 있는 최소한계 값을 0.3 ng/ml 이하로 확인하였다. 특히 보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA 키트 검사에서는 독소 B형을 15 pg/ml까지 검출할 수 있었고, 이 결과는 마우스 바이오어세이 검사법보다 더 높은 민감도(20 pg/ml)를 보였다. 또한 이 두 키트는 보툴리눔 독소 E형, 파상풍 독소, 황색포도알균 장독소 B형과 같은 다른 독소에 의한 교차반응 없이 보툴리눔 독소 A 또는 B만을 검출하는 높은 특이도를 확인하였다.

향후 보툴리눔 독소 A 샌드위치 ELISA 키트는 독소의 민감도를 높이기 위한 추가 연구를 수행하여 최소 검출한계 값을 개선하고 검증할 예정이다. 이 키트에 사용된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 특이적인 항체(22B3, 19B7)는 특허로 출원된 상태이며, 진단뿐만 아니라 독소를 중화시키는 항체 치료제로 연구에 사용할 수 있으며, 실제로 마우스 실험에서 높은 중화능을 확인한 바 있다. 따라서 본 연구에서 개발한 보툴리눔 독소 샌드위치 ELISA 키트는 검사에 최소 4일 이상이 걸리는 마우스 바이오어세이 및 균 배양검사법의 단점을 보완하여 보툴리눔독소증 환자 집단 발생 시, 혈청 검체를 이용해 최대 1일 이내에 독소형 및 독소량을 확인할 수 있으며 위급한 환자에게 신속한 치료의 방향을 제시하여 적절한 치료제를 사용할 과학적 근거를 제공할 수 있을 것이다.

Declarations

Acknowledgments: None.

Ethics Statement: Not applicable.

Funding Source: Korea Disease Control and Prevention Agency, 4840-302-210-13.

Conflict of Interest: The authors have no conflicts of interest to declare.

Author Contributions: Conceptualization: JHJ. Data curation: ESC, SHK. Formal analysis: ESC, SHK. Funding acquisition: JHJ. Investigation: ESC. Methodology: ESC. Project administration: JHJ, SHK. Supervision: YSC, HJY. Validation: CES. Writing – original draft: ESC, SHK. Writing – review & editing: YSC, HJY, SHK.

Fig 1.

Figure 1.보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 검사법 도식화
(A) Capture 항체를 플레이트에 코팅. (B) 플레이트 차단. (C) 항원샘플 추가. (D) 비오틴이 표지된 detection 항체 추가. (E) 스트렙타비딘-HRP 접합체 추가. (F) 기질용액에 의한 효소-기질 반응. HRP=horseradish peroxidase.
Public Health Weekly Report 2023; 16: 1491-1503https://doi.org/10.56786/PHWR.2023.16.44.1

표 1. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 민감도 측정.

샌드위치 ELISA 키트최소 검출한계 값(평균 흡광도)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)
보툴리눔 독소 A0.1040.153
보툴리눔 독소 B0.1170.027

표 2. 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 정밀도 측정.

정밀도 검사보툴리눔 독소 A 키트보툴리눔 독소 B 키트
최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)최소 검출가능 독소 농도(ng/ml)변동계수(%)
키트 내 반복성0.1667.80.03310.4
키트 간 반복성0.1327.20.0181.6
실험자 간 재현성0.274.10.0153.3

표 3. 다양한 독소(0.5 μg/ml)를 이용한 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트의 특이도 측정.

키트독소평균 흡광도±표준편차결과자료 및 참조
보툴리눔 독소 A 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 A1.421±0.309+Metabiologics
보툴리눔 독소 B0.214±0.002Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.147±0.022Metabiologics
파상풍 독소0.118±0.016Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소 B
0.130±0.007Sigma Aldrich
사람 혈청0.143±0.062Sigma Aldrich
보툴리눔 독소 B 샌드위치 ELISA보툴리눔 독소 B2.912±0.062+Metabiologics
보툴리눔 독소 A0.179±0.014Metabiologics
보틀리눔 독소 E0.060±0.003Metabiologics
파상풍 독소0.060±0.001Sigma Aldrich
황색포도알균
장독소B
0.060±0.000Sigma Aldrich
사람 혈청0.122±0.012Sigma Aldrich

References

  1. Cheng LW, Land KM, Stanker LH. Current methods for detecting the presence of botulinum neurotoxins in food and other biological samples. In: Morse S, editor. Bioterrorism. InTech; 2012. p.1-16.
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  4. National botulism surveillance summary, 2008-2019 [Internet]. Centers for Disease Control and Prevention [cited 2023 Aug 25]. Available from: https://www.cdc.gov/botulism/surveillance.html
  5. Legal communicable disease/Botulism/Statistics [Internet]. Korea Disease Control and Prevention Agency; 2023 [cited 2023 Aug 25]. Available from: https://npt.kdca.go.kr/npt/biz/npp/ist/simple/simplePdStatsMain.do#
  6. Stanker LH, Merrill P, Scotcher MC, Cheng LW. Development and partial characterization of high-affinity monoclonal antibodies for botulinum toxin type A and their use in analysis of milk by sandwich ELISA. J Immunol Methods 2008;336:1-8.
    Pubmed CrossRef
  7. Ozanich RM, Baird CL, Bartholomew RA, Colburn HA, Straub TM, Bruckner-Lea CJ. Biodetection technologies for first responders. 2014 ed. Pacific Northwest National Laboratory; 2014.
    CrossRef
PHWR
Jul 18, 2024 Vol.17 No.28
pp. 1215~1241

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PHWR 주간 건강과 질병
PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT
질병관리청 (Korea Disease Control and Prevention Agency)

eISSN 2586-0860
pISSN 2005-811X