PHWR 질병관리청 공식학술지
주간 건강과 질병(Public Health Weekly Report)

2019년 12월 중국 후베이성 우한에서 원인을 알 수 없는 호흡기 폐렴 사례가 발생한 이후로 사람과 사람 사이의 전파를 통해 지역사회 감염을 넘어 전 세계로 급속하게 펴져 나갔다. 이 원인 바이러스는 코로나 바이러스 중 하나이며, 기존의 알려진 Severe acute respiratory syndrome (SARS) 코로나 바이러스와는 유전적으로 상이한 신종임이 밝혀졌으며, 전 세계적 확산에 따라 현재 코로나바이러스감염증-19 원인 병원체(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2)의 유전적 계통이 점점 다양해지고 있다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 긴급자문위원회(Technical Advisory Group on SARS-CoV-2 Virus Evolution)는 2021년 11월 오미크론 변이 바이러스를 주요 변이 바이러스(Variant of Concern)로 분류하였다[1,2]. 또한 오미크론은 390개의 세부계통으로 재분류되었으며, 이 중에 BA.5는 140개, BA.4는 20개, BA.2는 172개의 세부계통으로 재분류 되었다(2022년 10월) [3,4]. 국내에서는 지난 2022년 5월과 7월에 BA.4/BA.5 및 BA.2.75가 각각 확인되어 2022년 11월을 기준으로 BA.5 세부계통(BF.7, BQ.1, BQ.1.1 포함) 검출률이 85.1%, BA.2.75 세부계통(BN.1 포함) 검출률은 11.6%이다[5].

경북권질병대응센터 진단분석과에서는 코로나19 확진자에 대한 유전자 검출 검사 및 유전자 분석을 실시하여 권역 내 코로나19 유행주 분석 및 진단분석에 기반한 과학적 방역에 기여하고 있다. 유전자 검출 검사를 위하여 E와 ORF1ab 유전자 또는 E와 RdRp 유전자 등을 검출하는 국내 제조사 시약을 사용하고 있다. 유전자 분석으로 코로나19 변이 바이러스 선별검사(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR), 특정 유전자(S gene) 염기서열 분석 및 전장유전체 분석을 실시하고 있다.

국내 시판 중인 코로나19 유전자 진단 시약 대부분은 코로나19 바이러스 유전자의 특정 부위(E, ORF1ab, RdRp 등)를 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR) 기법을 이용하여 해당 표적 유전자를 실시간으로 검출한다. 동일한 유전자 검출 시약을 사용했을 경우, 동일 검체 내 표적 유전자(2개 또는 3개)의 Ct 값(cycle threshold value)이 일반적으로 일정한 값이 확인되나, 최근 경북권역 내 일부 코로나19 확진자에서 검출된 코로나19 바이러스 유전자가 동일 유전자 검출 시약을 사용하였음에도 서로 다른 Ct 값이 확인되었다.

이러한 결과를 토대로 하여, 본 연구에서는 코로나19 유전자 검출 검사를 수행하였을때 코로나19 특정 유전자 Ct 값이 상이한 검체에 대해 코로나19 바이러스의 전장유전체 분석을 통하여 변이 세부 계통을 확인하였다. 또한 확보한 유전자 변이를 바탕으로 유전자 검출 검사에 미치는 영향을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석함으로써 유전자 진단 시약 선택 시 참고할 수 있도록 제안하고자 하였다.

1. 분석 대상

2022년 2–3월 동안 경북지역 군위군, 청도군 및 의성군 일대에서 코로나19 확진자와 접촉하여 선별진료소(보건소)를 내원하여 코로나19가 확진되었던 13명의 임상 검체(구‧비인두 도말)을 확보하여 분석하였다.

2. 코로나19 진단 검사

코로나19 확진자 13명의 임상 검체로부터 바이러스 유전자를 추출하여 코로나19 바이러스의 E 유전자와 ORF1ab 유전자를 동시에 검출 가능한 국내 제조회사(B사) 진단시약을 사용하여 Real-time RT-PCR기법(Applied Biosystems^TM 7500 Fast Real-Time PCR System, ThermoFisher Scientific)을 활용하여 시약 제조사 기준 internal control (IC) 및 양성 판정 기준에 따라 양성으로 확인하였다.

3. 전장유전체 정보 분석 및 GISAID 등록

코로나19 확진자로부터 추출한 바이러스 유전자를 TaqMan^TM 2019 nCoV Assay kit v1 (Applied Biosystems^TM)을 사용하여 정량하고 Genexus^TM Integrated Sequencer (Ion Torent Genexus System, ThermoFisher Scientific)와 Ion AmpliSeq^TM SARS-CoV-2 Insight Research Assay GX 등 전장유전체 분석 시약(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 전장유전체 분석을 실시하였다. 확보한 코로나19 전장유전체는 SARS-CoV-2-Panglin과 CLC Main Workbench (Version 21.0.3, QIAGEN)를 사용하여 세부계통과 유전체 염기서열을 비교 분석하였다. 확보한 전장유전체 서열을 Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data (GISAID) 데이터베이스에 등록하여 등록 번호를 확보하였다[3,4].

4. 인실리코 분석

컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하는 가상 실험을 실시하여 13명 코로나19 확진자로부터 확보한 코로나19 유전자가 국내 허가 및 시판 중인 5개 사의 진단시약(A, B, C, D, E)으로 검출 가능한지 분석하였다(질병관리청 신종병원체분석과).

1. 코로나19 진단

본 연구의 분석 대상인 코로나19 확진자는 경상북도 군위군보건소에서 9명, 청도군보건소에서 1명, 의성군보건소에서 3명으로 총 13명이었다. 성별 분포는 남성 6명, 여성 7명이었으며, 연령은 9–65세로 평균 33세이었다. B사 진단 시약을 사용하여 유전자 검출 검사한 결과 군위군에서 확보한 6명(1–6번)은 ORF1ab 유전자의 Ct 값과 비교 시 E 유전자가 증폭되지 않거나 Ct 값이 현저하게 증가되는 현상을 확인하였다. 군위군에서 확보한 3명, 청도군에서 확보한 1명과 의성군에서 확보한 3명에서는 E 유전자의 Ct 값과 비교 시 ORF1ab 유전자가 미증폭 되거나 Ct 값이 증가되는 현상을 확인하였다(표 1).

표 1경북지역 코로나19 확진자의 유전자 검출 검사 결과

연번	나이	성별	거주지역	유전자 진단 결과(Ct 값)		GISAID 등록 번호	주요 특성
				ORF1ab	E
1	65	여	군위	18.08	-	hCoV-19/South_Korea/KDCA33801/2022	E gene 미증폭 또는 Ct 값 증가
2	55	남	군위	23.1	34.31	hCoV-19/South_Korea/KDCA33847/2022
3	56	남	군위	23.68	31.37	hCoV-19/South_Korea/KDCA33848/2022
4	43	여	군위	20.52	26.58	hCoV-19/South_Korea/KDCA33846/2022
5	35	여	군위	20.05	28.65	hCoV-19/South_Korea/KDCA33845/2022
6	9	여	군위	21.24	31.23	hCoV-19/South_Korea/KDCA33844/2022
7	38	여	군위	19.15	16.61	hCoV-19/South_Korea/KDCA42754/2022	ORF1ab gene 미증폭 또는 Ct 값 증가
8	10	남	군위	19.07	16.71	hCoV-19/South_Korea/KDCA42756/2022
9	39	남	군위	22.06	19.11	hCoV-19/South_Korea/KDCA42800/2022
10	39	여	청도	19.36	16.46	hCoV-19/South_Korea/KDCA42801/2022
11	12	남	의성	-	20.06	hCoV-19/South_Korea/KDCA43171/2022
12	14	남	의성	38.23	19.01	hCoV-19/South_Korea/KDCA43172/2022
13	14	여	의성	38.14	18.91	hCoV-19/South_Korea/KDCA43173/2022

Ct=cycle threshould; GISAID=Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data; -=not detected..

2. 전장유전체 분석

코로나19 바이러스 전장유전체 정보 분석을 통하여 2022년 2–3월 동안 경상북도에서는 오미크론 세부변이 BA.1 계통과 BA.2 계통이 동시에 유행하는 것을 확인하였다. 경북지역 13명에서 확보한 코로나19 바이러스의 전장유전체 염기서열은 커버리지(coverage) 97%, depth 2,600x 이상으로 모두 변이 세부계통은 오미크론형이고 5명은 BA.1.1, 4명은 BA.2로 나머지 4명은 BA.2.3으로 확인(Pangolin version 4.1.3)되었다. 확보한 13건의 전장유전체 염기서열은 GISAID 데이터베이스에 등록하여 등록번호를 확보하였다(표 2).

표 2코로나19 바이러스 오미크론 세부계통 및 분석 대상의 주요 변이 부위

연번	GISAID	팽고 계통	판골린 버전	타켓 부위 주요 변이	분석 대상의 주요 변이
1	GRA	BA.2.3	4.1.3	T9I, R61C on E gene	T9I, R61C
2		BA.1.1	4.1.3	T9I, R61H on E gene	T9I, R61H
3		BA.1.1	4.1.3
4		BA.1.1	4.1.3
5		BA.1.1	4.1.3
6		BA.1.1	4.1.3
7		BA.2	4.1.3	T24I, L142W, G171V, G489S on NSP3	T24I, L142W, G171V, G489S
8		BA.2	4.1.3
9		BA.2	4.1.3	T24I, L142W, G489S on NSP3	T24I, L142W, G489S
10		BA.2	4.1.3	T24I, F25L, E26N, D28M, E29K, R30G, I31L, D32I, V34Y, N36M, E37R, K38del, C39del, Y42L, T43P, V44I, E45Q, G47N, T48S, L142W, G171V, G489S on NSP3	T24I, F25L, E26N, D28M, E29K, R30G, I31L, D32I, V34Y, N36M, E37R, K38del, C39del, Y42L, T43P, V44I, E45Q, G47N, T48S, L142W, G171V, G489S
11		BA.2.3	4.1.3	166–178 deletion on NSP3	166-178 deletion
12		BA.2.3	4.1.3
13		BA.2.3	4.1.3

GISAID=Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data; C=cysteine; D=aspartic acid; del=deletion; E=glutamic acid; F=phenylalanine; G=glycine; I=isoleucine; K=lysine; L=leucine; M=methionine; N=asparagine; NSP3=multi-domain non-structural protein 3; P=proline; Q=glutamine; R=arginine; S=serine; T=threonine; V=valine; W=tryptophan; Y=tyrosine..

ORF1ab 유전자의 Ct 값과 비교 시 E 유전자가 증폭되지 않거나 Ct 값이 증가되는 현상을 보인 1–6번 확진자에서 확보한 샘플로 코로나19 전장유전체 분석 결과, E 유전자 부위에서 공통적으로 T9I 변이가 확인되었고 이들 중 1번(BA.2.3)에서는 R61C 변이가 2-6번(BA.1.1)에서는 R61H변이가 확인되었다. 한편 ORF1ab 유전자가 미증폭 되거나 Ct 값이 증가되는 현상을 보인 7–10번(BA.2) 환자에서 확보한 코로나19 바이러스 전장유전체 분석 결과에서는 NSP3 유전자 부위에 T24I, L142W, G489S 변이가 공통적으로 확인되었고 이외에도 10번(BA.2)에서는 추가적으로 변이가 다수 확인되었다. 11–13번(BA.2.3)에서는 NSP3 유전자 부위에 연속적으로 유전자가 결손(166–178)되어 있었다(표 2).

전장유전체 정보 분석 결과는 total reads 97% 이상, coverage의 depth (CD) 2,600_× 이상으로 확보한 전장유전체 정보는 양호하였고, 주요 변위(E gene상에서 R61C, R61H, 그리고 NSP3상에서 L142W, G171V) 위치는 CD는 1,121_× 이상, 변이 빈도율(frequency)은 93% 이상으로 확인되었다(표 3).

표 3코로나19 전장유전체 분석 특성 및 주요 변이 발생 빈도

연번	맵핑된 리드	콘센서스	맵핑된 리드/전체리드(%)	커버리지 정도	게놈커버리지(%)	E gene						NSP3
						R61C			R61H			L142W			G171V
						커버리지	빈도(%)		커버리지	빈도(%)		커버리지	빈도(%)		커버리지	빈도(%)
1	606,419	29,849	99.50	3,042	99.80	1,788	99.2		-	-		-	-		-	-
2	1,554,483	29,855	98.70	7,798	99.80	-	-		2,684	93.3		-	-		-	-
3	1,482,940	29,855	98.80	7,439	99.80	-	-		3,564	98.5		-	-		-	-
4	1,398,424	29,822	98.40	7,015	99.70	-	-		2,038	98.6		-	-		-	-
5	1,883,778	29,855	98.40	9,449	99.80	-	-		3,172	98.2		-	-		-	-
6	1,513,983	29,855	98.40	7,595	99.80	-	-		2,930	98.3		-	-		-	-
7	1,316,138	29,603	98.80	6,602	99.00	-	-		-	-		3,963	97.3		1,121	98.7
8	1,119,320	29,795	98.90	5,615	99.60	-	-		-	-		4,125	97.7		1,258	98.3
9	1,091,099	29,710	98.40	5,473	99.40	-	-		-	-		3,993	98		-	-
10	3,570,992	29,843	98.80	17,913	99.80	-	-		-	-		18,048	97.8		5,822	98.5
11	528,461	29,212	97.90	2,651	97.70	-	-		-	-		-	-		-	-
12	1,332,872	29,549	98.40	6,686	98.80	-	-		-	-		-	-		-	-
13	1,371,159	29,515	99.00	6,878	98.70	-	-		-	-		-	-		-	-

-=not applicable; C=cysteine; G=glycine; H=histidine; L=leucine; R=arginine; V=valine; W=tryptophan..

3. 표적 유전자 인실리코 분석

확보한 13건의 전장유전체 정보를 바탕으로 국내 시판 중인 5종의 진단시약이 표적 유전자의 검출 부위 변이를 확인할 수 있는가를 컴퓨터 프로그램 기반으로 분석한 결과 E 유전자 부위 변이는 B사 진단시약 사용 시 검출 가능한 것으로 확인되었고, ORF1ab 유전자 영역의 NSP3 유전자 부분 변이와 일부 영역 결손이 확인된 7–10번 및 11–13번의 샘플의 경우 B사 진단시약으로 검출이 어려운 것으로 확인되었다. 추가적으로 A사와 E사 진단시약을 사용할 경우 S와 E 유전자의 검출이 어려운 것으로 확인되었다(표 4).

표 4인실리코 유전자 분석 프로그램을 이용한 검출 가능 시약 비교

연번	진단시약	검출 표적 유전자	검출 가능 유전자	검출 불가 유전자	양성 판정 기준(Ct 값)
1–6	A	RdRp, S, E, N	RdRp, E, N	S	≤40
	B	ORF1ab, E	ORF1ab, E	없음	≤38
	C	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤36
	D	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤38
	E	ORF1ab, S, E, N	ORF1ab, S, N	E	≤38
7–10	A	RdRp, S, E, N	RdRp, E, N	S	≤40
	B	ORF1ab, E	E	ORF1ab	≤38
	C	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤36
	D	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤38
	E	ORF1ab, S, E, N	ORF1ab, S, N	E	≤38
11–13	A	RdRp, S, E, N	RdRp, E, N	S	≤40
	B	ORF1ab, E	E	ORF1ab	≤38
	C	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤36
	D	RdRp, E	RdRp, E	없음	≤38
	E	ORF1ab, S, E, N	ORF1ab, S, N	E	≤38

Ct=cycle threshould; E=envelope; N=nucleoprotein; ORF1ab= open reading frame 1ab; RdRp=RNA-dependent RNA polymerase; S=spike..

코로나19 확진자의 임상 검체로부터 코로나19 바이러스의 전장유전체 분석을 통하여 변이 세부계통 확인 및 국내 유행주를 분석하고 바이러스 전체유전자 영역을 대상으로 유전자 변이가 발생하는 부위를 확인하였다. 코로나19 바이러스의 전장유전체 정보를 바탕으로 인실리코 분석 결과 E 유전자 부위의 R61C 또는 R61H 변이는 본 연구에서 비교한 B사 진단 시약의 표적 유전자 위치가 아니므로 유전자 진단에 영향을 미치지 않았다. 표적인 E 유전자 이외 영역 또는 다른 원인 등에 의해 해당 유전자 검출 감도가 낮아지는 것으로 추정된다. 또한 일부 검체에서 확인된 ORF1ab 유전자 부분의 NSP3 L142W 변이에 따른 영향으로 B사 진단검사 시약으로 유전자 검출 시 Ct 값이 증가되었고, ORF1ab 유전자 부분의 166–178 영역 유전자 결손으로 동일한 B사 진단검사 시약으로 유전자 검출이 안 된 것으로 판단된다.

Garg 등[6]은 5개의 임상 검체를 7종류의 코로나19 진단시약과 자체 개발한 유전자 검출 검사법으로 Real-time RT-PCR을 실시하여 약양성인 검체에서는 진단시약 종류에 따라 음성으로 판정되는 경우가 있음을 보고하였다. 병원에 입원한 코로나19 환자 중 354명을 무작위로 선정하여 핵산 추출 조건을 동일하게 하고 한 개의 PCR 장비를 사용하여 3개 진단 시약(Sansuer Biotech, GeneFinder^TM, TaqPath^TM)으로 Real-time RT-PCR 실시 후 Ct 값을 비교한 결과 검출 시약 간에 통계적으로 차이가 없었으나 Sansuer Biotech 진단 시약의 성능이 조금 더 좋은 것으로 보고하였고 개선을 위한 필수 사항으로 cut-off Ct 값의 결정과 새로운 변이 출현에 따른 신속한 프라이머 개발을 제시하였다[7]. 네덜란드 연구팀은 2개의 표적 유전자를 검출하는 진단시약으로 ORF1ab와 E 유전자의 Ct 값을 각각 20.7과 30.2로 확인하였고 바이러스의 ORF1ab 영역에 5개의 독특한 변이가 있음을 보고하면서 분자진단법에 활용되는 유전자 영역 분석의 중요성을 강조하였다[8].

본 연구에서 비교한 진단시약은 표적 유전자가 2가지 이상이므로 한가지 진단시약에서 예상하지 못한 결과(표적 유전자 중 한가지만 양성으로 판정되는 경우 등)가 도출될 경우, 표적이 다른 진단시약을 사용하여 특정 유전자 변이에 따른 진단검사 영향을 최소화 할 수 있었다. 식품의약품안전처에 허가받은 진단시약은 표적 유전자 및 판정기준을 공개하고 있으므로[9] 전장유전체 분석을 통하여 확보한 코로나19 바이러스의 유전자 변이 정보를 바탕으로 표적 유전자 영역에 변이가 적은 진단시약을 선택하는데 활용할 수 있다(표 4). 또한 최근 코로나19 오미크론 세부 변이가 다양하게 발생하고 유전자 변이 및 결손 양상 역시 예측할 수 없이 발생하고 있는 상황으로 코로나19 바이러스 전장유전체 정보 분석을 통하여 지속적인 유전자 변이의 출현에 대한 모니터링 결과는 분자진단법의 개선에 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

We acknowledge to staff in the Division of Emerging Infectious Diseases in Korea Disease Control and Prevention Agency for the additional analysis of in silico and gene mutation sites based on the full-length genome sequence of the SARS-CoV-2.

Not applicable.

None.

The authors have no conflicts of interest to declare.

Conceptualization: HSY, WYC. Data curation: HSY, GRM. Formal analysis: HJK, SHO. Investigation: JJP, HGC, YPL, Methodology: HSY, HGC. Resources: JJP, CIL. Software: HGC, SHO. Supervision: WYC, CKS. Validation: HSY. Visualization: HSY. Writing – original draft: HSY. Writing – review & editing: WYC.